MiR-17-5p調(diào)控非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分主要miRNA在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者和對(duì)照組患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)差異研究
　　目的:觀(guān)察非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者與骨性關(guān)節(jié)炎患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中主要miRNA的表達(dá)差異，尋找在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用的miRNA。
　　方法:大量查閱文獻(xiàn)后找到參與調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，成脂分化，增殖相關(guān)過(guò)程的主要備選miRNA10個(gè)，分別為：miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，mi

2、R-96-5p，miR-124-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p。臨床上收集了20例非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以及10例對(duì)照組患者原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)上述10個(gè)miRNA的在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中的表達(dá)。
　　結(jié)果:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a

3、，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），miR-96-5p，miR-124-3p在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p可能通過(guò)靶向于不同的mRNA調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化與

4、增殖，在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理過(guò)程中起作用。
　　第二部分miR-17-5p調(diào)控SMAD7在HMSC-bm成骨分化過(guò)程中表達(dá)的研究
　　目的：miR-17-5p在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者M(jìn)SC中表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)找到并確定miR-17-5p的靶基因，并檢測(cè)其在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者M(jìn)SC標(biāo)本中的表達(dá)水平以及在HMSC-bm成骨分化過(guò)程中的表達(dá)水平變化規(guī)律。

5、　　方法：使用TargetScan6.2與Pictar網(wǎng)站進(jìn)行miR-17-5p靶基因預(yù)測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)第一部分中20個(gè)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者M(jìn)SC標(biāo)本中SMAD7表達(dá)水平，以及其與miR-17-5p表達(dá)水平是否具有相關(guān)性。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BMP-2誘導(dǎo)的HMSC-bm成骨分化過(guò)程中第0,1,2,4,6天miR-17-5p及SMAD7表達(dá)水平變化趨勢(shì)（與不加入BMP-2的對(duì)照組進(jìn)行比較）。在HMSC-bm細(xì)胞中使用miR-17-

6、5p類(lèi)似物與miR-17-5p抑制劑調(diào)整miR-17-5p表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SMAD7表達(dá)水平，Western蛋白印跡試驗(yàn)檢測(cè)Smad7濃度。采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法，檢測(cè)miR-17-5p與SMDA7是否具有調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果： SMAD7通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可能是miR-17-5p的靶基因，結(jié)合SMAD7的生理作用我們認(rèn)為miR-17-5p可能通過(guò)靶向抑制SMAD7在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理過(guò)程中起調(diào)控作用。Rea

7、l-time PCR結(jié)果顯示在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者M(jìn)SC標(biāo)本中miR-17-5p與SMAD7表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（R2=0.5440，p=0.0002）。在BMP-2誘導(dǎo)的HMSC-bm成骨分化過(guò)程中miR-17-5p的表達(dá)水平自誘導(dǎo)后第一天起顯著高于對(duì)照組（p<0.05），SMAD7的表達(dá)水平自誘導(dǎo)后第二天起顯著低于對(duì)照組（p<0.05）。miR-17-5p類(lèi)似物組SMAD7表達(dá)水平與Smad7蛋白濃度顯著高于陰性對(duì)照組，miR-17-

8、5p抑制劑組SMAD7表達(dá)水平與Smad7蛋白濃度顯著低于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)示miR-17-5p通過(guò)靶向抑制SMAD7下調(diào)其表達(dá)。結(jié)論： miR-17-5p通過(guò)不完全互補(bǔ)結(jié)合SMAD7的3’UTR端靶向抑制其表達(dá)，在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病過(guò)程及MSC成骨分化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　第三部分miR-17-5p促進(jìn)HMSC-bm細(xì)胞增殖及成骨分化的機(jī)制研究
　　目的：研究miR

9、-17-5p提高HMSC-bm細(xì)胞系增殖與成骨分化的機(jī)制。
　　方法：在HMSC-bm細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-17-5p類(lèi)似物與miR-17-5p抑制劑調(diào)整miR-17-5p表達(dá)水平并設(shè)立陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后加入100ng/ml BMP-2進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。6天后實(shí)時(shí)定量PCR觀(guān)察RUNX2以及Ⅰ型膠原表達(dá)水平改變，通過(guò)ALP染色觀(guān)察HMSC-bm細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)強(qiáng)度，通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖的改變。為了證明HMSC-bm細(xì)胞

10、增殖及成骨分化增強(qiáng)是通過(guò)SMAD7表達(dá)水平下降而導(dǎo)致的，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SMAD7人為提高SMAD7表達(dá)水平，觀(guān)察以上效應(yīng)是否減弱及逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)果：在BMP-2誘導(dǎo)的HMSC-bm成骨分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)染miR-17-5p類(lèi)似物組RUNX2，COL1A1的表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照組（p<0.05），堿性磷酸酶表達(dá)顯著高于對(duì)照組，細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑組RUNX2，Ⅰ型膠原的