非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者股骨頭骨組織的差異蛋白組學(xué)研究.pdf

1、研究背景：股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由不同原因?qū)е碌墓晒穷^骨髓造血細(xì)胞、骨髓脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞變性壞死的一種疾病,為骨科臨床常見(jiàn)病之一。主要分為創(chuàng)傷性(traumatic osteonecrosis of femoralhaead TONFH)和非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(non-traumatic osteonecrosis of femoralhead,NONFH)兩大類。有資

2、料表明股骨頭缺血性壞死已取代了原髖關(guān)節(jié)結(jié)核的位置,居髖關(guān)節(jié)疾病的首位。股骨頭壞死病因復(fù)雜,病程緩慢,治療困難,致殘率高,是長(zhǎng)期以來(lái)困擾國(guó)內(nèi)外學(xué)者的醫(yī)學(xué)難題,有“不死的癌癥”之稱。而目前臨床上由于缺乏有效的早期篩查和檢測(cè)手段,很少能在股骨頭壞死早期發(fā)現(xiàn)從而進(jìn)行藥物或手術(shù)干預(yù),因此大多數(shù)患者直到出現(xiàn)疼痛,活動(dòng)受限才來(lái)就診,此時(shí)多是處于股骨頭塌陷變形、骨性關(guān)節(jié)炎等病變晚期,只能施行人工髖關(guān)節(jié)置換手術(shù),最終導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降以及國(guó)家家庭個(gè)人的

3、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)增加。因此,明確股骨頭壞死的原因,弄清其發(fā)病機(jī)制,尋找有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物(biomarker),以期早期篩查發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死并進(jìn)行早期治療,是臨床和實(shí)驗(yàn)室專家一直努力研究的方向。
　　 創(chuàng)傷性股骨頭壞死病因比較明確,但非創(chuàng)傷性股骨頭壞死確切病因和發(fā)病機(jī)制仍存在眾多爭(zhēng)論。目前激素性和酒精性股骨頭缺血性壞死仍被普遍認(rèn)為是非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死最常見(jiàn)的原因。研究者們相繼提出了10多種學(xué)說(shuō),有脂肪代謝紊亂、血管內(nèi)凝血、微血管損

4、傷等。10余種學(xué)說(shuō)所涉及多種酶類、細(xì)胞因子等,它們都是蛋白質(zhì)。眾所周知,蛋白質(zhì)是正常生理活動(dòng)和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的執(zhí)行者和參與者。以往對(duì)蛋白質(zhì)的研究只是針對(duì)生命活動(dòng)中某一或某幾種蛋白質(zhì),難以從整體、系統(tǒng)上闡明生命活動(dòng)的基本機(jī)制。因此,大規(guī)模、全方位的蛋白質(zhì)研究勢(shì)在必行。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是從整體水平上研究蛋白質(zhì)表達(dá)、組成及活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科。其研究?jī)?nèi)容主要包括三個(gè)部分:表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(ExpressionPro

5、teomics)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(Structural Proteomics)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)(Functional Proteomics)。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)是指對(duì)一個(gè)指定的細(xì)胞、組織或生物所產(chǎn)生全部蛋白質(zhì)的鑒定。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)是指對(duì)上述全部蛋白質(zhì)一級(jí)和三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定。功能蛋白質(zhì)組學(xué)則是闡明蛋白質(zhì)的生理功能以及機(jī)體在不同時(shí)期中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。蛋白組學(xué)的研究可以實(shí)現(xiàn)與基因組的對(duì)接與確認(rèn),直接揭示人類重大疾病發(fā)生與發(fā)展的病理機(jī)制。<

6、br>　　 蛋白質(zhì)組學(xué)在大多數(shù)骨科疾病的研究方面還處于初步階段。近年來(lái)關(guān)于股骨頭壞死的蛋白質(zhì)組學(xué)研究多集中在患者的血清學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨組織方面的研究。少數(shù)幾項(xiàng)血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也已發(fā)現(xiàn)多種蛋白的高表達(dá)與股骨頭缺血性壞死密切相關(guān)。但存在的問(wèn)題是:血清蛋白質(zhì)成分不穩(wěn)定,極易受機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的背景干擾,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性較差；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)和人體存在一定差異。這些蛋白質(zhì)組學(xué)研究大多基于常規(guī)雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù),存在一定的局限性:①上樣量的

7、限制使低豐度蛋白質(zhì)(<1 ng)難以檢測(cè)；②電泳結(jié)果需染色處理,而不同的蛋白質(zhì)與染料結(jié)合的差異較大；③目前尚不能全自動(dòng)處理,耗時(shí)長(zhǎng),不能進(jìn)行高通量分析。
　　 熒光差異凝膠電泳(difference gel electrophoresis,DIGE)技術(shù)由于繼承了二維凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)的高分辨率,同時(shí)又具備高重現(xiàn)性、高靈敏度、高通量和高動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)勢(shì),使得DIGE

8、日益受到關(guān)注,成為目前最受歡迎的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究手段之一。
　　 骨組織蛋白的提取主要有化學(xué)法和物理法兩大類。幾項(xiàng)人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的骨組織蛋白質(zhì)組學(xué)的研究采取的是化學(xué)方法,雖然該法能夠從多種骨組織中分離出蛋白質(zhì)并將低豐度蛋白有效地鑒別出來(lái),但耗時(shí)較長(zhǎng),約需一周時(shí)間,容易導(dǎo)致蛋白的分解變性,不適合做后續(xù)的Western blot研究。2009年王簕等應(yīng)用錘擊研磨法提取骨組織蛋白,簡(jiǎn)便易行,不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)成和理化性質(zhì),值得借鑒。<

9、br>　　 目的：探討非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制,為篩選可能生物學(xué)標(biāo)志物和分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：本研究共分四個(gè)部分。第一部分,骨組織樣本的收集。臨床上經(jīng)影像學(xué)和病理確診的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死實(shí)行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者,取壞死股骨頭骨組織,修剪成骨粒狀,置于-80℃冰箱備用,以新鮮股骨頸骨折患者的股骨頭骨組織為對(duì)照。第二部分,建立骨組織的熒光差異雙向電泳圖譜。使用液氮研磨法提取骨組織總蛋白,利用熒光差異凝膠電泳(D

10、IGE)技術(shù)分離蛋白質(zhì),掃描分析建立圖譜,尋找差異蛋白。第三部分,明顯差異蛋白質(zhì)的鑒定和生物信息學(xué)分析。挖取差異表達(dá)2倍以上的蛋白質(zhì),行基質(zhì)輔助激光解析離子化-飛行時(shí)間/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)鑒定,數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,獲得這些蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)和功能信息,結(jié)合文獻(xiàn),對(duì)感興趣蛋白行生物信息學(xué)分析。第四部分,差異蛋白的Western blot驗(yàn)證。選取載脂蛋白A1和ATP合成酶(ATP5β),運(yùn)用蛋白免疫印跡(Western

11、blot)技術(shù),再次行蛋白質(zhì)定量分析,驗(yàn)證DIGE結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果：通過(guò)DIGE成功分離1600±50個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),明顯差異蛋白點(diǎn)274個(gè),利用EttanTM Spot picker自動(dòng)工作站挖取表達(dá)差異達(dá)2倍以上的明顯差異蛋白點(diǎn)50個(gè),利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,共鑒定出9種蛋白質(zhì),分別是載脂蛋白A1(APOA1)、熱休克蛋白β-1(HSPβ-1)、ATP合成酶β亞基(ATP5β

12、)、纖維蛋白原γ鏈(FGG)、纖維蛋白原β鏈(FGB)、血清白蛋白(ALB)、硫氧蛋白過(guò)氧化物還原酶(PRDX2)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、肌動(dòng)蛋白(ACTG1),除纖維蛋白原表達(dá)有下調(diào)外,其余蛋白均表達(dá)上調(diào)。通過(guò)多種數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,這些蛋白分別涉及參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝、能量代謝、細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原等方面的功能,并進(jìn)行亞細(xì)胞定位、相互作用等生物學(xué)信息學(xué)分析。選取載脂蛋白A1(APOA1)和ATP合成酶(ATP5β)做Westernblo

13、t,結(jié)果與DIGE結(jié)果相符。
　　 結(jié)論:
　　 1.使用液氮研磨提取骨組織總蛋白的物理方法,簡(jiǎn)便有效,可以滿足后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,對(duì)蛋白質(zhì)圖譜影響小。
　　 2.運(yùn)用熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)可以高效分離骨組織蛋白質(zhì)組,獲得股骨頭壞死的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜。
　　 3.通過(guò)對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析鑒定,獲得了9種蛋白質(zhì),通過(guò)生物學(xué)信息學(xué)分析,這些蛋白質(zhì)可能與股骨頭壞死

14、的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),為篩選用于診斷的生物學(xué)標(biāo)志物、為該疾病的分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 4.通過(guò)Western blot對(duì)載脂蛋白A1和ATP合成酶表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果和DIGE結(jié)果一致,證明了以上研究的準(zhǔn)確性和可靠性。
　　 創(chuàng)新點(diǎn):經(jīng)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索,使用DIGE和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)方法對(duì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者股骨頭骨組織進(jìn)行蛋白組學(xué)分析的研究,未見(jiàn)報(bào)道。本研究直接采集股骨頭壞死患者的壞死股骨頭骨組