重組合異種骨復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞對兔非創(chuàng)傷性股骨頭壞死修復(fù)的實驗研究.pdf

1、目的：1.探討體外骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的體外分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。2.探討血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)基因轉(zhuǎn)染MSCs的表達。3.研究重組合異種骨(RBX)復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs對非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head.NONFH)修復(fù)的治療療效。 方法：1.MSCs取自4-6月齡2.5-3.5kg的青紫蘭兔，用貼壁培養(yǎng)篩選法結(jié)合密度梯度離心

2、法進行分離培養(yǎng)后行細胞表型的鑒定。2.采用脂質(zhì)體Lipofcetin轉(zhuǎn)染法將hVEGF-165基因轉(zhuǎn)染進入骨髓間充質(zhì)干細胞，通過RT-PCR、Western Blot和免疫組化S-P法檢測轉(zhuǎn)染細胞外源性hVEGFl65基因瞬時表達與穩(wěn)定表達。3。用局部液氮冷凍法建立兔NONFH模型24只(共48髖)，隨機分為治療組和對照組，各24髖。治療組股骨頭壞死區(qū)植入復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓問充質(zhì)干細胞的重組合異種骨，對照組僅植入重組合異種骨，行X

3、線大體標本，組織病理檢查及股骨骨密度和礦物質(zhì)含量檢查，所得數(shù)據(jù)輸入SPSS1 3.0軟件進行統(tǒng)計分析，比較兩組組間及組內(nèi)的差異是否具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：1.本實驗分離培養(yǎng)的MSCS形態(tài)學特征明顯，免疫細胞化學方法鑒定結(jié)果為CD44、CD90陽性表達，CD34陰性表達。2.基因轉(zhuǎn)染后MSCs生長增殖良好，基因轉(zhuǎn)染后72h和篩選培養(yǎng)4周后，RT-PCR、Western Blot和免疫組化都能檢測到VEGF基因的轉(zhuǎn)錄及表達，而空載體

4、轉(zhuǎn)染組未見其轉(zhuǎn)錄及表達。3.在X線上，兩組第2周，相差不大，壞死區(qū)密度均較低；第6周時治療組壞死區(qū)出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)，新骨形成增加，骨密度較對照組高；第12周時治療組股骨頭形態(tài)規(guī)則，密度均勻，接近于正常兔股骨頭密度，對照組股骨頭壞死區(qū)有囊狀低密度區(qū)。骨密度和礦物質(zhì)含量測定上，2周時兩組比較無明顯差別，6周和12周時兩組差異有顯著差異性(p<0.01)。在組織學上，2周時所有兔股骨頭骨細胞、軟骨細胞、骨髓細胞完全壞死，骨小梁完整；6周時治療組

5、骨細胞及微毛細血管明顯多于對照組；12周治療組新生骨組織修復(fù)達軟骨下，對照組植入骨塊仍有少量未吸收。 結(jié)論：1.采用梯度密度離心法分離結(jié)合貼壁篩選法可獲得較高純度和活性的MSCs，并能大量增殖；2.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)能成功的將hVEGF165基因轉(zhuǎn)入MSCs，使其在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有VEGF的穩(wěn)定表達。3.重組合異種骨復(fù)合VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞不僅能促進毛細血管的生成，而且有明顯的成骨誘導(dǎo)作用，能有效促進非創(chuàng)傷性股骨