兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨誘導(dǎo)復(fù)合異種松質(zhì)骨修復(fù)兔尺骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究經(jīng)定向成骨誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合異種松質(zhì)骨移植修復(fù)兔尺骨骨缺損的能力及特點(diǎn)，為骨組織工程治療骨缺損選擇理想的種子細(xì)胞來(lái)源及合適的支架材料尋求一種新的方法。
　　方法：
　　先取新生24h內(nèi)新西蘭大白兔顱蓋骨，采用改良酶消化法提取兔成骨細(xì)胞(osteoblast，0B);再取2周齡新西蘭大白兔四肢長(zhǎng)骨，采用密度梯度離心法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞化學(xué)染色、MTT法測(cè)

2、定細(xì)胞增殖等檢測(cè)，對(duì)兩種原代細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　取第3代BMSCs和OB，應(yīng)用Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板將兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)共設(shè)三組:A組上室接種OB，B組和C組上室均未接種細(xì)胞，B組使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，C組使用BMSCs生長(zhǎng)液培養(yǎng)作為空白對(duì)照組，三組培養(yǎng)下室均接種BMSCs。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、茜素紅染色、BMSCs上清液中堿性磷酸酶和骨鈣素測(cè)定，RT-PCR檢測(cè)骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)

3、行鑒定。
　　取檢疫合格的豬股骨髁部松質(zhì)骨，經(jīng)處理制成生物型異種松質(zhì)骨。使用前BMSC生長(zhǎng)液浸泡6h，晾干后接種定向成骨誘導(dǎo)的BMSCs，體外培養(yǎng)一周，顯微鏡下觀察成骨誘導(dǎo)的BMSCs在異種松質(zhì)骨支架上的粘附、生長(zhǎng)情況，MTT法測(cè)定支架上細(xì)胞增殖情況。
　　取6月齡新西蘭大白兔36只，采用完全隨機(jī)抽樣的方法，抽取30只新西蘭大白兔每組15只作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其余6只作為空白對(duì)照組，隨機(jī)選取一側(cè)前肢制作尺骨中段15mm節(jié)段性

4、骨缺損模型。按照植入物不同分為三組:實(shí)驗(yàn)組:缺損處植入成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合異種松質(zhì)骨;對(duì)照組:缺損處植入異種松質(zhì)骨;空白對(duì)照組:不植入任何材料。于術(shù)后4、8、12周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組處死5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取標(biāo)本，通過(guò)X線檢查、標(biāo)本大體觀察和骨缺損區(qū)HE組織化學(xué)染色，及術(shù)后12周兔尺骨缺損區(qū)幾何參數(shù)測(cè)量，比較各組骨缺損的修復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞的提取和鑒定:密度梯度離心法提取BMSCs，操作簡(jiǎn)單、細(xì)胞純度高，得到的細(xì)胞呈

5、長(zhǎng)梭形;改良酶消化法提取成骨細(xì)胞，耗時(shí)短、細(xì)胞產(chǎn)出率高，得到的細(xì)胞呈短梭形或多角形。兩種原代細(xì)胞經(jīng)鑒定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
　　2.BMSCs定向成骨誘導(dǎo)分化:Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板法和成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)法兩組細(xì)胞上清液中AKP、OCN含量在同時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)上檢測(cè)結(jié)果顯示兩者無(wú)明顯差異(P＞0.05)，兩組成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞茜素紅染色均為陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)兩組成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞OCN和CollagenⅠ的mRNA均有表達(dá)

6、。
　　3.異種松質(zhì)骨的制備與成骨誘導(dǎo)的BMSCs復(fù)合培養(yǎng):經(jīng)去抗原處理后的異種松質(zhì)骨，外觀呈白色至淡黃色、疏松多孔狀。接種細(xì)胞后顯微鏡下觀察細(xì)胞在異種松質(zhì)骨支架材料上生長(zhǎng)良好，MTT法測(cè)定結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間增加細(xì)胞數(shù)量增多。
　　4.骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn):X線觀察:術(shù)后4、8、12周顯示實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)骨痂量明顯多于對(duì)照組及空白組。X線評(píng)分結(jié)果:各組均隨時(shí)間延長(zhǎng)得分逐漸增多，實(shí)驗(yàn)組與其他各組相比差異均有顯著性意義(P＜0.05）

7、。組織學(xué)觀察:術(shù)后4、8、12周實(shí)驗(yàn)組形成的編織骨量明顯多于對(duì)照組和空白組。術(shù)后12周標(biāo)本幾何參數(shù)測(cè)量:實(shí)驗(yàn)組尺骨骨痂中分處的冠狀徑、矢狀徑和骨痂厚度明顯大于對(duì)照組和空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.密度梯度離心法提取BMSCs和改良酶消化法提取成骨細(xì)胞是較為優(yōu)良的原代細(xì)胞提取方法。
　　2.Transwell雙層細(xì)胞培養(yǎng)板法能使BMSCs定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，但不適合大規(guī)模應(yīng)用。