脫細(xì)胞骨基質(zhì)聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)動(dòng)物骨缺損實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、根據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)每年大約有一千三百二十萬(wàn)人次發(fā)生骨折，其中有10～15％無(wú)法愈合，另外，每年因?yàn)樽鲫P(guān)節(jié)置換手術(shù)、外傷、骨骼發(fā)育異常，或是其它原因造成的骨科手術(shù)高達(dá)一百萬(wàn)例，而在這一百萬(wàn)個(gè)手術(shù)中，約有四十五萬(wàn)個(gè)手術(shù)是需要接受骨移植的。然而，骨移植的材料來(lái)源不論在數(shù)量上或是在質(zhì)量上，卻是明顯不足的。骨科醫(yī)師在臨床上，經(jīng)常碰到的問題，就是骨折的處理，一般人發(fā)生骨折之后，只要有適當(dāng)?shù)奶幚?，大多?huì)如期愈合。在正常愈合所需的時(shí)間過后，如果尚未愈合，

2、就是延遲愈合。其原因包括骨折碎片間的間隙過大，固定不可靠，骨折碎片的血液供應(yīng)不足，開放性骨折合并廣泛軟組織損傷及感染等等。傳統(tǒng)上是解除原因,延長(zhǎng)愈合時(shí)間持續(xù)治療，但仍然不愈合，就是骨折不愈合。治療骨折不愈合可用物理性刺激，或是使用骨移植手術(shù)的方法。臨床上，通常骨移植物來(lái)源于自體骨移植：即〝取〞患者自己身上的骨來(lái)〝種〞到需要的部位，如：髂骨、腓骨或肋骨取下的骨頭，移植到需要的部位。一般來(lái)說(shuō)，自體骨移植塊的效用最佳，且不會(huì)發(fā)生疾病傳播及排斥

3、反應(yīng)問題，但由于數(shù)量有限，且未能提供夠強(qiáng)的大塊骨移植塊，因此應(yīng)用范圍會(huì)受限。而異體骨移植，即取自其它人捐贈(zèng)骨骼進(jìn)行骨移植，須經(jīng)過特殊處理（如低溫冰凍、冷凍干燥、輻射處理等），降低其抗原性，以減小排斥現(xiàn)象，并且確定無(wú)感染病原后才可使用。但是異體移植骨來(lái)源有限，價(jià)格昂貴，必須在無(wú)菌狀態(tài)下儲(chǔ)存，且保存日期有限，依保存方法而有差異。異體骨移植塊的缺點(diǎn)為可能傳播肝炎病毒及艾滋病病毒，值得注意。此外，大塊異體骨移植塊通常會(huì)發(fā)生骨移植塊與宿主骨骼間的

4、融合延緩，以及骨移植塊發(fā)生吸收或疲乏性骨折等問題。因此，本文研究的重點(diǎn)在于同種異體移植，即將同種骨經(jīng)過Triton X-100處理后，去除主要的抗原成分，留下礦物質(zhì)及部分有機(jī)成分，作為骨移植塊使用。Meezan首先使用化學(xué)除垢劑制作了無(wú)細(xì)胞基底膜，Wilson又首先以Triton X-100為主脫去組織中的所有細(xì)胞、抗原、脂質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖胺多糖等物質(zhì)。其中他采用的除垢劑酶消化方法對(duì)狗頸總動(dòng)脈行脫細(xì)胞處理，組織學(xué)及電鏡觀察無(wú)細(xì)

5、胞成分存在，在基質(zhì)中主要為膠原和彈性蛋白，結(jié)構(gòu)保存良好。美國(guó)Lifecell公司用同樣方法制作真皮基質(zhì)獲得了商業(yè)性的成功。Dahms對(duì)處理的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)成分分析表明了其主要成分為Ⅰ型、Ⅲ型膠原和彈性蛋白。因此，就目前所用的脫細(xì)胞處理的方法而言，其基本上保留了促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的生物活性成分，為其植入體內(nèi)修復(fù)及再生損傷或缺損的組織提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。這樣我們有理由相信采用同樣方法制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)能夠提供漸進(jìn)式替換作用的骨架，加上自體骨髓間充

6、質(zhì)干細(xì)胞的作用，在體外聯(lián)合培養(yǎng)后，最終能夠修復(fù)動(dòng)物的骨缺損。
　　本研究的主要方法和結(jié)果：
　　1、脫細(xì)胞骨基質(zhì)的制備
　　實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用過氧化氫、低滲Tris-Hcl和TritonX-100制備了脫細(xì)胞骨基質(zhì)，之后通過HE染色見新鮮的大鼠松質(zhì)骨組織切片中可見骨陷窩中含有大量細(xì)胞結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列整齊；處理組骨陷窩、骨小管中尚有嗜酸性物質(zhì)殘留；處理組標(biāo)本可見細(xì)胞成分基本消失,骨陷窩、骨小管空虛,膠原纖維排列整齊。甲苯胺藍(lán)

7、染色見正常骨松質(zhì)的骨小梁膠原纖維排列成行，骨細(xì)胞占據(jù)的骨陷窩分布在骨小梁。骨陷窩中骨細(xì)胞核清晰可見，大多數(shù)骨陷窩內(nèi)只有一個(gè)骨細(xì)胞核。脫細(xì)胞骨的細(xì)胞外基質(zhì)膠原纖維排列整齊，染色呈不同程度藍(lán)色，橢圓形骨陷窩內(nèi)空虛，無(wú)骨細(xì)胞核及其他結(jié)構(gòu)。
　　2、免疫組化染色
　　免疫組化染色見實(shí)驗(yàn)組支架材料的纖維連接蛋白和層粘連蛋白的染色陽(yáng)性部位在BAECM的骨陷窩周邊部，染色較深,呈篩網(wǎng)狀、線狀分布,為清晰棕色。
　　3、掃描電鏡觀察<

8、br>　　掃描電鏡可見骨支架是由大量片狀骨小梁連接而成的多孔網(wǎng)架，形似海綿狀。骨小梁之間的孔隙直徑在200～400m之間，孔間隔厚度為60～100 m。孔隙率為60%，孔洞之間有連聯(lián)。處理后的骨支架的孔隙內(nèi)已無(wú)骨髓成分。掃描電鏡下可見骨小梁上的許多平行排列的骨陷窩，且骨陷窩內(nèi)已無(wú)細(xì)胞成分。
　　4、透射電鏡觀察
　　透射電鏡可見脫細(xì)胞骨基質(zhì)的骨陷窩多為低密度影像，有多處空白區(qū)，可見少量洗脫殘留物質(zhì)；對(duì)照新鮮骨基質(zhì)的骨陷窩中明

9、顯含有細(xì)胞成分，并可見細(xì)胞核的核仁。免疫組織化學(xué)透射電鏡可見在脫細(xì)胞骨基質(zhì)的骨陷窩周邊彌散存在陽(yáng)性標(biāo)記電子密度較高的DAB反應(yīng)產(chǎn)物呈團(tuán)塊，網(wǎng)狀分布，基質(zhì)可見網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列整齊。
　　5、洗脫劑殘留量測(cè)定
　　洗脫劑 TritonX-100殘留量測(cè)定見對(duì)照品出峰時(shí)間分別為2.495、4.008、4.009min，峰面積948825、1652336、1645545。樣品在3min左右無(wú)峰值出現(xiàn)。最低檢出極限為0.5l

10、/ml。
　　6、移植免疫分析
　　移植免疫分析在術(shù)后4、8周各植入處理組的血清中均可檢測(cè)出抗體，各時(shí)間處理檢測(cè)組與其相應(yīng)的無(wú)關(guān)抗原對(duì)照組之間差異非常顯著(P<0.01)，說(shuō)明抗體是針對(duì)SD大鼠骨抗原的特異性抗體。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：新鮮骨移植組血清抗體相對(duì)OD值最高，與脫細(xì)胞骨基質(zhì)差異非常顯著(P<0.01)。淋巴細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中經(jīng)兩種移植物第一次體內(nèi)致敏后，在體外用SD大鼠脾淋巴細(xì)胞二次刺激，新鮮骨移植組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)最高

11、，與脫細(xì)胞骨基質(zhì)移植組有顯著差異(P<0.01)，植入SD大鼠兩種移植物術(shù)后8周，再在體外給予相應(yīng)移植物二次刺激組中，新鮮骨刺激淋巴細(xì)胞增殖，而脫細(xì)胞骨基質(zhì)表現(xiàn)為對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制(P<0.01)。
　　7、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
　　鏡下觀察見大鼠BMSCs的原代細(xì)胞剛接種時(shí)呈圓形，多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中，可見克隆形成。48h后大部分細(xì)胞都貼壁，換液除去未貼壁的細(xì)胞后，可見部分貼壁細(xì)胞形態(tài)不一，呈梭形的成纖維細(xì)胞樣或多角形改

12、變，核較大，位于細(xì)胞中央或邊緣。3～4天開始出現(xiàn)散在的貼壁生長(zhǎng)的成纖維樣的細(xì)胞，再過2～3天，細(xì)胞呈現(xiàn)克隆樣生長(zhǎng)的集落，集落細(xì)胞增殖迅速，7天左右每個(gè)集落約含有100～200個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)基本為紡錘形的成纖維細(xì)胞樣，部分呈寬大扁平的多邊形，約9～11天時(shí)融合成單層，一般能夠達(dá)到70%～80%的細(xì)胞融合狀態(tài)。
　　8、流式細(xì)胞儀鑒定
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)見培養(yǎng)的第3代BMSCs均一表達(dá)CD90、CD44、CD106，陽(yáng)性率分別

13、為90.05%、95.48%、67.22%；而CD34、CD45、CD11b陰性，陽(yáng)性率分別為1.02%、0.86%、0.32%。
　　9、誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)觀察
　　倒置顯微鏡下觀察可見多數(shù)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由梭形轉(zhuǎn)化為圓形或方形，且胞體增大，胞核變大變圓，胞漿中可見較多細(xì)小黑色顆粒，胞核色較淡，胞漿色較深，胞核與胞漿對(duì)比明顯。
　　10、誘導(dǎo)后的細(xì)胞鑒定
　　茜素紅染色見部分細(xì)胞成聚集生長(zhǎng)，形成礦化結(jié)節(jié)，茜

14、素紅染色顯示為橘紅色；鈣鈷法堿性磷酸酶染色顯示胞漿中一些細(xì)小黑色顆粒為棕黑色；I型膠原免疫熒光染色陽(yáng)性，紅色熒光（Cy3）表示I型膠原在細(xì)胞內(nèi)的分布，I型膠原多在胞漿靠近胞核處，藍(lán)色熒光(DAPI)為細(xì)胞核。
　　11、掃描電鏡觀察聯(lián)合培養(yǎng)的脫細(xì)胞骨基質(zhì)與誘導(dǎo)后的成骨樣細(xì)胞
　　聯(lián)合培養(yǎng)24，48，72h后，掃描電鏡觀察并未見脫細(xì)胞骨基質(zhì)組和羥基磷灰石組之間的細(xì)胞形態(tài)有明顯差異，細(xì)胞在兩組材料上均生長(zhǎng)良好，且分布均勻，細(xì)胞形

15、態(tài)大小不一，但在兩組材料中均可見大量的球形細(xì)胞黏附在材料上面，每個(gè)細(xì)胞直徑在3~10m之間，在個(gè)別部位還可見正在增殖中的細(xì)胞克隆，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　12、堿性磷酸酶檢測(cè)
　　隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脫細(xì)胞骨基質(zhì)組和羥基磷灰石組的堿性磷酸酶表達(dá)活性都呈上升趨勢(shì)。在浸提液培養(yǎng)12h和24h，兩組之間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)；在培養(yǎng)48h和72h，脫細(xì)胞骨基質(zhì)組和羥基磷灰石組之間差異有顯著性意義(P<0.05)。

16、　　13、復(fù)合細(xì)胞的天然脫細(xì)胞骨支架修復(fù)骨缺損實(shí)驗(yàn)
　　成功制作大鼠股骨骨缺損模型后，將復(fù)合有細(xì)胞的脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料移植在缺損處，術(shù)后4周熒光顯微鏡見對(duì)照組羥基磷灰石支架在鏡下顯現(xiàn)為黑色條影，周邊可見發(fā)出綠色熒光的新生骨組織，實(shí)驗(yàn)組天然脫細(xì)胞骨松質(zhì)已經(jīng)能夠非常完好地與周邊新生骨組織融合在一起，熒光顯微鏡下無(wú)法分辨出其間的差別。普通光鏡觀察見術(shù)后4周及8周的對(duì)照組羥基磷灰石顯示為黑色條帶陰影，而脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架之間已填滿新生的骨

17、組織，骨支架與新生骨組織很好的融合在一起。偶可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；術(shù)后8周甲苯胺藍(lán)染色可見對(duì)照組羥基磷灰石顯示為黑色條帶陰影，而對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的支架之間都可以見到已形成的骨單位，新生骨組織已經(jīng)比較成熟。
　　研究結(jié)論：
　　1、利用大鼠股骨成功制備了適于同種異體移植的組織工程骨基質(zhì)；
　　2、利用動(dòng)物自身的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功地誘導(dǎo)為成骨樣細(xì)胞；
　　3、制備的脫細(xì)胞骨基質(zhì)在體外適于誘導(dǎo)而來(lái)的成骨樣細(xì)胞的生長(zhǎng)；