谷胱甘肽對激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究
　　目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有無限增殖能力和多向分化潛能，在特定的條件下可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種中胚層來源組織細(xì)胞，MSCs可用于臨床治療股骨頭壞死、脊髓損傷、免疫相關(guān)疾病。本研究旨在探討成人骨髓MSCs分離、純化、培養(yǎng)及鑒定的方法，觀察其向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化過程中形態(tài)

2、學(xué)特征，檢測在成骨分化過程中 Runx2基因的表達(dá)情況和成脂分化過程中 PPAR-γ基因的表達(dá)情況。
　　方法：無菌環(huán)境下抽取人股骨近端骨髓，采用密度梯度離心聯(lián)合差異貼壁法分離骨髓MSCs，體外擴(kuò)增和傳代培養(yǎng)，使用計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)統(tǒng)計(jì)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、CD45、CD90的表達(dá)情況。MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力。誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)人骨髓MSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，觀察形態(tài)學(xué)改變。并采用RT-PCR和Weste

3、rn blot方法檢測在分化過程中Runx2和PPAR-γ的動態(tài)表達(dá)。
　　結(jié)果：原代和傳代細(xì)胞呈紡錘狀外觀，生長增殖能力良好，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線呈成“S”形，細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物CD90呈陽性表達(dá)，CD34和CD45呈陰性表達(dá)。經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞分別呈現(xiàn)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的表型特征。在成骨誘導(dǎo)分化過程中，RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，Runx2的表達(dá)也明顯增加，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)

4、學(xué)差異（P<0.05）。同樣，經(jīng)定向成脂誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞分別呈現(xiàn)脂肪的表型特征，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，PPAR-γ的表達(dá)也明顯增加，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：該方法能從人骨髓中高效分離和擴(kuò)增MSCs，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能，能為骨組織工程提供理想的種子細(xì)胞。
　　第二部分激素性股骨頭壞死患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目、功能及分化能力變化的相關(guān)研究
　　目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)

5、胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)成骨成脂分化的動態(tài)平衡對維持人體內(nèi)骨代謝穩(wěn)態(tài)起著重要作用。在激素的干預(yù)下，骨代謝平衡被打破，進(jìn)而產(chǎn)生異常的生理生化反應(yīng)，最終演變發(fā)展為股骨頭壞死。本文旨在研究激素性股骨頭壞死患者M(jìn)SCs的數(shù)目、功能和成脂成骨分化能力是否改變,并探討氧化應(yīng)激在分化過程中的作用。
　　方法：選取2012年9月-2013年12月就診32例激素性股骨頭壞死患者

6、，21例外傷性股骨頸骨折患者。經(jīng)患者書面同意和武漢協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審批后，在手術(shù)室無菌條件下抽取患者股骨骨髓10 ml。經(jīng)密度梯度離心貼壁法體外分離、培養(yǎng)MSCs，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用10μM谷胱甘肽對股骨頭壞死組MSCs進(jìn)行干預(yù)，比較各組MSCs的集落形成能力，檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、細(xì)胞成骨和成脂分化能力以及關(guān)鍵因子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：激素性股骨頭壞死組MSCs與股骨頸骨折組相比較，集落形成能力顯著下降，活性氧水平顯著

7、升高(P<0.05)，谷胱甘肽干預(yù)后，集落形成能力升高，活性氧水平水平下降，與壞死組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。誘導(dǎo)分化染色結(jié)果顯示，激素性股骨頭壞死組MSCs成骨分化能力低于股骨頸骨折組，而成脂分化能力高于股骨頸骨折組，谷胱甘肽干預(yù)組較股骨頭壞死組成骨能力增強(qiáng)而成脂能力減弱。PCR和western blot結(jié)果表明，激素性股骨頭壞死組Runx2、ALP的表達(dá)水平顯著低于股骨頸骨折組(P<0.05)，谷胱甘肽干預(yù)后能上調(diào)Run

8、x2、ALP的表達(dá)(P<0.05)。PPAR-γ、C/EBP的表達(dá)情況恰好相反。
　　結(jié)論：激素性股骨頭壞死患者M(jìn)SCs數(shù)量和功能均下降，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，成骨能力下降，成脂能力增強(qiáng)。谷胱甘肽可以通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平逆轉(zhuǎn)這種變化。
　　第三部分谷胱甘肽在激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能失調(diào)中的作用
　　目的：細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的異常增加是激素性股骨頭壞死的重要原因，本研究的目的是評估抗氧化劑谷胱甘肽對激素

9、誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和成脂成骨關(guān)鍵因子表達(dá)水平的影響。
　　方法：用10μ M的地塞米松處理人MSCs，模擬激素性股骨頭壞死細(xì)胞模型，用不同濃度(5μ M,10μ M,50μ M)谷胱甘肽的對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，共5個(gè)組分別為：正常組（A組），激素誘導(dǎo)組（B組），5μ M谷胱甘肽干預(yù)組（C組），10μ M谷胱甘肽干預(yù)組（D組），50μ M谷胱甘肽干預(yù)組（E組），在細(xì)胞培養(yǎng)7d后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，real-

10、time PCR和western bolt技術(shù)檢測成骨成脂關(guān)鍵基因表達(dá)的水平，在細(xì)胞培養(yǎng)21后，油紅O染色觀察細(xì)胞成脂分化情況。結(jié)果：激素誘導(dǎo)21d，油紅 O染色顯示，MSCs出現(xiàn)明顯的成脂分化。激素誘導(dǎo)7d，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平增加，經(jīng)谷胱甘肽干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平下降；real-time PCR和western bolt結(jié)果顯示成脂轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ、C/EBP水平明顯升高，成骨轉(zhuǎn)錄因子 RUNX2、ALP水