骨髓間充質(zhì)干細胞治療激素性股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　股骨頭壞死包括骨細胞、骨髓組織和脂肪細胞的壞死,晚期股骨頭會發(fā)生塌陷、變形,髖關(guān)節(jié)間隙變窄甚至消失,臨床表現(xiàn)主要為髖關(guān)節(jié)疼痛和活動范圍受限。目前該病早期缺乏有效的治療方法,晚期只有全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(THA)才可以有效改善髖關(guān)節(jié)功能。在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中,激素性股骨頭壞死的發(fā)病率最高,其發(fā)病年齡低、病情進展快的特點決定了很多患者在比較年輕的時候接受了THA。由于假體壽命的限制,年輕時接受該手術(shù)難免要行1次甚至多次翻修

2、術(shù),不僅要承受多次手術(shù)的痛苦和經(jīng)濟壓力,翻修術(shù)的效果也明顯不如初次置換,因此,在激素性股骨頭壞死的早期控制病情發(fā)展具有十分重要的意義。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是組織工程常用的種子細胞,在股骨頭壞死的治療中有著廣闊的應用前景,就BMSCs的來源、分離與培養(yǎng)方法、移植途徑等方面還需進一步研究。血管內(nèi)皮生長因子(vEGF)在骨與血管生成的調(diào)控中居于中心地位,在其5種異構(gòu)體中VEGF-α是發(fā)揮作用的主要成分,其表達水平可有效反映骨組織的生

3、理狀態(tài)。目前對骨組織中該因子表達的研究多停留在定性階段,采用熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)定量比較不同組之間VEGF-α的表達水平,可以更精確的分析BMSCs移植后骨組織生理狀態(tài)的變化。本研究采用激素法建立股骨頭壞死動物模型,從自體脛骨骨髓中分離BMSCs體外培養(yǎng)并移植,在組織病理學觀察的基礎上采用RT-PCR技術(shù)定量檢測VEGF-α的表達來評估治療效果,以探索早期股骨頭壞死的治療方法。
　　材料與方法：
　　實驗一

4、r>　　1.約3月齡的新西蘭大白兔20只,隨機分為模型組與對照組,每組10只,模型組肌肉注射甲潑尼龍琥珀酸鈉20mg/kg,共1次,對照組同時肌肉注射等量生理鹽水。所有動物肌肉注射青霉素鈉4×105IU,每周2次。
　　2.給藥6周后,空氣栓塞法處死所有動物,嚴格無菌操作取下雙側(cè)股骨頭,一側(cè)置于10%福爾馬林溶液中固定,另一側(cè)凍存于-80℃低溫冰箱中,分別用于組織病理觀察和RT-PCR檢測。
　　實驗二
　　1.約3月

5、齡新西蘭大白兔30只,隨機分為A(動物模型組)、B(生理鹽水組)、C(BMSCs治療組)3組,每組各10只。所有動物采用與實驗一相同的方法建立動物模型,用藥后肌肉注射青霉素鈉4×105IU,每周2次。
　　2.給藥4周后C組動物在靜脈麻醉下抽取雙側(cè)自體脛骨骨髓約10ml,簡單離心法分離BMSCs并體外培養(yǎng),傳代1次后制成細胞懸液。
　　3.C組動物靜脈麻醉后用手搖鉆在左側(cè)大轉(zhuǎn)子下鉆孔,將細胞懸液注入骨髓腔,B組動物采用相同方

6、法注入等量生理鹽水,術(shù)后所有動物肌肉注射青霉素鈉4×105IU,每天1次,5天后改為每周2次。
　　4.移植術(shù)后4周空氣栓塞法處死所有動物,嚴格無菌操作取出左側(cè)股骨頭,沿冠狀面剖開,一半置于10%福爾馬林溶液中固定用于組織病理觀察,另一半凍存于-80℃低溫冰箱中留作RT-PCR檢測,觀察VEGF-α表達的變化。
　　結(jié)果：
　　實驗一
　　組織病理切片(HE染色):模型組9例標本進入結(jié)果分析,病理觀察可見軟骨下區(qū)

7、骨組織內(nèi)出現(xiàn)大量空骨陷窩,脂肪細胞體積與排列紊亂,細胞邊界不清,骨髓組織中細胞數(shù)量減少、細胞核固縮,可見均質(zhì)紅染的壞死區(qū),部分標本可見骨小梁斷裂,模型組9例標本中有7例診斷為骨壞死,對照組沒有標本符合骨壞死診斷標準。RT-PCR檢測:模型組VEGF-α的表達較對照組明顯降低。
　　實驗二
　　組織病理切片(HE染色):C組標本中空骨陷窩的分布明顯少于另外兩組,脂肪細胞的體積與排列較A、B兩組規(guī)則,骨髓組織中細胞非常密集;而A

8、、B兩組脂肪細胞體積與排列紊亂,細胞邊界不清,骨髓組織中細胞數(shù)量較少,可見均質(zhì)紅染的壞死區(qū)。C組中有2例診斷為骨壞死,而A、B組中各有7例符合骨壞死診斷標準。
　　RT-PCR檢測:C組VEGF-α的表達最高,與A、B組相比均有統(tǒng)計學差別,A組和B組之間的差別沒有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.短期大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊可顯著抑制血管內(nèi)皮生長因子-α(VEGF-α)的表達。
　　2.兔自體脛骨骨髓是骨髓間充質(zhì)干細