人激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞差異表達(dá)miRNA篩選與miRNA-23a抑制干細(xì)胞成骨分化及機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　激素性股骨頭壞死(steroid-induced femoral head necrosis，SFHN)是由于長期使用激素類藥物，導(dǎo)致以股骨頭血供受損，骨細(xì)胞及骨髓成份死亡，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變、股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙為特征的代謝性疾病。大約75％的患者從診斷SFHN起3年內(nèi)便可發(fā)生股骨頭塌陷，最終超過65％的患者不得不接受髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)，給患者家庭和社會帶來了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。探索SFHN的發(fā)病機制，從而及

2、時有效地干預(yù)SFHN的進(jìn)展將具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
　　SFHN發(fā)病機制的研究，國內(nèi)外均未取得突破性進(jìn)展。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對SFHN的發(fā)病機制進(jìn)行了深入的研究，并提出了眾多學(xué)說，其中包括骨內(nèi)高壓學(xué)說、凝血機制改變學(xué)說、脂肪栓塞學(xué)說、骨質(zhì)疏松學(xué)說、骨細(xì)胞凋亡學(xué)說、膜微粒學(xué)說等等。至今，SFHN具體的發(fā)病機制仍不清楚，尚需進(jìn)一步的研究。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem c

3、ells，BMSC)是骨髓中一類具有多向分化潛能并在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要病理生理作用的細(xì)胞。體外實驗發(fā)現(xiàn)大劑量糖皮質(zhì)激素可通過糖皮質(zhì)激素受體(GR)和激活蛋白-1(AP-1)途徑抑制BMSC的增殖和成骨分化，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者轉(zhuǎn)子部位成骨細(xì)胞的增殖能力下降。microRNA(miRNA)作為細(xì)胞內(nèi)一類重要的非編碼調(diào)控分子，它所介導(dǎo)的調(diào)控作用已經(jīng)被認(rèn)為是多細(xì)胞生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平的一種普遍調(diào)節(jié)方式。許多miRNA已被

4、證明參與了骨質(zhì)形成的過程，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。BMSC結(jié)合miRNA是研究SFHN發(fā)病機制的一個新的視角，存在為SFHN提供早期診斷與治療的潛在價值。
　　本課題將應(yīng)用miRNA芯片篩選出調(diào)控SFHN相關(guān)的miRNA;對于我們篩選出的目標(biāo)miRNA，進(jìn)一步驗證其功能，然后應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、siRNA等技術(shù)探討其調(diào)控機制，以期闡明激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制。
　　方法：
　　1、BMSC的分離、培養(yǎng)與鑒定:從

5、3例健康者和5例激素性股骨頭壞死并接受外科手術(shù)治療的患者體內(nèi)取出骨髓，按照已建立的密度梯度離心法，獲取BMSC，并培養(yǎng)傳代，并對細(xì)胞表型、成骨等功能活性進(jìn)行了初步的檢驗。
　　2、差異性miRNA的篩選:在成骨分化過程中，對正常BMSC、激素性股骨頭壞死BMSC和大劑量地塞米松刺激的BMSC提取RNA，然后通過基因芯片的方法測定miRNA表達(dá)情況，并篩選出差異性miRNA。
　　3、差異性表達(dá)miR-23a的功能驗證:將mi

6、R-23a的mimics和inhibitor導(dǎo)入正常BMSC，模擬過表達(dá)miR-23a和低表達(dá)miR-23a，然后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，在3天、6天、9天和12天進(jìn)行堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、Real Time PCR、westem blot及ALP活性檢測，進(jìn)一步驗證候選miR-23a對成骨作用的影響。
　　4、miR-23a抑制BMSC成骨分化的機制:首先通過專業(yè)的靶基因預(yù)測網(wǎng)站，對候選miR-23a的靶基因進(jìn)行初步的預(yù)測，然后通過

7、雙熒光素酶實驗，驗證靶基因與miR-23a的結(jié)構(gòu)匹配性，最后通過siRNA干擾技術(shù)，進(jìn)一步驗證靶基因。最后通過通路抑制劑干擾具體的信號通路，驗證miR-23a信號傳導(dǎo)的具體通路。
　　結(jié)果：
　　1、成功分離出BMSC，并通過流式細(xì)胞儀對其表型進(jìn)行了鑒定，并通過相關(guān)染色、Real Time PCR的方式鑒定了其潛在的成骨分化能力。
　　2、大劑量地塞米松刺激BMSC和激素性股骨頭壞死BMSC中，miR-423-5p、m

8、iR-193b*、miR-744、miR-214、miR-423-3p、miR-320a、miR-140-3p等7個miRNAs表達(dá)下降，miR-152、miR-23a、miR-425、miR-27a、miR-221、miR-151-5p、miR-22、miR-224*等8個miRNAs表達(dá)上調(diào)。
　　3、選取miR-23a進(jìn)行功能試驗。細(xì)胞水平、蛋白水平和mRNA水平顯示，miR-23a抑制成骨，結(jié)果與上述芯片結(jié)果相一致。