刀豆蛋白A致小鼠急性肝損傷IL-6介導(dǎo)的miR-674-5p-5-LO調(diào)控機制研究.pdf

1、研究背景與目的:肝炎的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，其中病理性免疫反應(yīng)引發(fā)肝組織中眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)異常分泌發(fā)揮了關(guān)鍵作用?；ㄉ南┧峤?jīng)由5-脂氧合酶(5-1ipoxygenase，5-LO)代謝通路激活的炎性終產(chǎn)物與各種肝損傷密切相關(guān)，但5-LO通路在刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)誘導(dǎo)急性肝炎被激活的調(diào)控機制仍遠未闡明。本研究采用經(jīng)典的Con A誘導(dǎo)小鼠T細胞介導(dǎo)的肝損傷，模擬人類自身免疫反應(yīng)性肝炎。重點探

2、索Con A誘發(fā)小鼠肝急性損傷始發(fā)階段，若干關(guān)鍵的細胞因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，力圖為闡明免疫性肝炎急性期病理機制提供實驗依據(jù)。
　　方法:雄性Balb/c小鼠隨機分為5組，每組6只。除溶劑對照組尾靜脈注射生理鹽水外，其他幾組動物均尾靜脈注射ConA(20 mg/kg)，2h處死。對上述損傷肝組織進行microRNAs（miRNAs）表達譜檢測及qRT-PCR驗證，篩選出差異表達的miRNAs（變化＞1.5倍，P＜0.0

3、5）。通過對差異表達miRNAs的生物信息學(xué)預(yù)測和分析，推測存在潛在負向調(diào)控的“miRNA-靶蛋白”對，并采用肝實質(zhì)細胞系，在外源性腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α）與白介素-6(interleukin-6，IL-6)微環(huán)境中，通過蛋白免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染miRNAs擬似物(mimic)后，靶蛋白的表達情況，進一步驗證“炎癥因子/miRNA/5-LO通路”這一體系在ConA誘導(dǎo)肝損傷過程中的調(diào)控機制。

4、
　　結(jié)果:基于本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Con A導(dǎo)致小鼠急性肝損傷的同時，炎性細胞因子TNF-α和IL-6顯著上調(diào);并且與5-LO催化生成的終產(chǎn)物炎癥介質(zhì)半胱氨酰白三烯（cysteinyl-leukotrienes，cysLTs）顯著升高相一致，提示兩者間可能存在相關(guān)性。使用免疫抑制劑環(huán)孢素A(CsA)預(yù)給藥，可見在緩解ConA所致肝損傷同時，選擇性抑制5-LO表達及其終產(chǎn)物cysLTs分泌上調(diào)。由此初步證明5-LO通路參與ConA

5、誘導(dǎo)急性免疫性肝損傷的直接作用。
　　MiRNAs芯片及qRT-PCR驗證結(jié)果篩選出與Con A處理相關(guān)的9個差異表達的miRNAs，再使用TargetScan等共8個生物信息學(xué)軟件，分別與5-LO通路上的潛在靶基因進行一對一的預(yù)測和分析，從中篩選出miR-674-5p對靶基因5-LO存在轉(zhuǎn)錄后負向調(diào)控作用。蛋白免疫印跡結(jié)果表明，miR-674-5p mimic穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的小鼠肝癌細胞系Hepa1-6細胞分別在IL-6刺激1小時、T

6、NF-α刺激4小時出現(xiàn)5-LO表達顯著下調(diào)(P＜0.01)。另有miR-674-5p mimic穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞系HepG2在IL-6刺激4小時5-LO表達顯著下調(diào)(P＜0.05)。上述體外實驗進一步驗證了IL-6相關(guān)miR-674-5p下調(diào)對5-LO表達增高的快速調(diào)控機制。
　　結(jié)論:在Con A誘導(dǎo)小鼠T細胞介導(dǎo)的急性肝損傷中，特定地經(jīng)由細胞因子IL-6下調(diào)miR-674-5p而使5-LO表達顯著增加，導(dǎo)致cysLTs分泌