CXCL16介導(dǎo)oX-LDL致阿霉素腎病小鼠足細(xì)胞損傷的機(jī)制及辛伐他汀干預(yù)研究.pdf

1、目的:
　　原發(fā)性腎病綜合征(Primary nephrotic syndrome，PNS)是兒童時(shí)期常見的腎小球疾病，其病理類型包括微小病變型、局灶節(jié)段性腎小球硬化、膜增殖性腎小球腎炎、膜性腎病等，其發(fā)病機(jī)制主要是由多種原因?qū)е碌哪I小球?yàn)V過屏障損傷引起，腎小球?yàn)V過屏障由內(nèi)向外由以下三層組成:內(nèi)層毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞，中層腎小球基底膜，外層腎小球的上皮細(xì)胞，即足細(xì)胞。足細(xì)胞損傷是腎小球?yàn)V過屏障受損的重要原因之一，目前越來越多的研究逐

2、漸認(rèn)識到足細(xì)胞損傷是腎臟損傷的早期靶點(diǎn)，大量研究證實(shí)，足細(xì)胞與基底膜粘附功能減弱在腎病綜合征的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。足細(xì)胞通過許多粘附分子錨定于基底膜上，其中α3β1整合素最為重要。既往關(guān)于足細(xì)胞上α3β1整合素的研究主要集中于糖尿病腎病，腎病綜合征中相關(guān)研究較為少見。CXC趨化因子配體16(chemokine ligand16，CXCL16)是2001年新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，具有清道夫受體功能，最新研究發(fā)現(xiàn)CXCL16參與腎

3、臟疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　本課題組前期研究顯示在阿霉素腎病發(fā)生發(fā)展中，足細(xì)胞上CXCL16可能與腎組織氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，ox-LDL)的沉積有關(guān)。但關(guān)于CXCL16如何引起腎組織足細(xì)胞ox-LDL沉積以及ox-LDL進(jìn)入足細(xì)胞后如何引起足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損，從而促進(jìn)阿霉素腎病的發(fā)生發(fā)展，目前尚未見報(bào)道。
　　高脂血癥是兒童PNS重要的病理生理表現(xiàn)之一

4、，以血漿中總膽固醇(totalcholesterol，TC)和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）升高較為顯著。臨床上可采用降脂藥物治療，降脂藥物一般選用以降膽固醇為主的羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑，即他汀類藥物，目前辛伐他汀應(yīng)用較為廣泛。他汀類藥物不僅可以通過降低血漿TC水平發(fā)揮其腎臟保護(hù)作用，還可以通過非依賴降血脂途徑起到保護(hù)腎臟作用，但確切機(jī)制尚不明確，其是否通過影響腎小球足細(xì)胞CXCL16

5、表達(dá)來干擾ox-LDL的細(xì)胞內(nèi)攝取，減少足細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，從而發(fā)揮其腎臟保護(hù)作用，目前國內(nèi)外少見報(bào)道。
　　本研究擬通過建立阿霉素腎病小鼠模型，觀察腎組織形態(tài)學(xué)、CXCL16、ox-LDL、NF-κB以及α3β1整合素等表達(dá)的變化，同時(shí)應(yīng)用小劑量辛伐他汀干預(yù)治療阿霉素腎病小鼠，觀察上述指標(biāo)的變化，旨在探討腎病綜合征中高脂血癥引起腎臟足細(xì)胞損傷的具體機(jī)制，并進(jìn)一步探討阿霉素腎病中辛伐他汀不依賴其降脂作用而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。<

6、br>　　方法:
　　將15只雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常對照組(NC組，n=5)、阿霉素腎病組（ADR組，n=5）以及辛伐他汀治療組(ADR-SIM組，n=5)。應(yīng)用阿霉素(ADR)誘導(dǎo)阿霉素腎病模型，造模成功后每天于固定時(shí)間給予對辛伐他汀治療組小鼠辛伐他汀4mg/kg灌胃，其余2組均用等量生理鹽水灌胃。7周后所有小鼠一次性處死，留取血液、24h尿液，摘取腎臟?？捡R斯亮藍(lán)G-250(CBB)法測定24h尿蛋白定量，全自動(dòng)生化

7、分析儀檢測血清膽固醇以及白蛋白水平，ELISA法檢測血清ox-LDL、IFN-γ水平，雙重免疫熒光法檢測腎小球足細(xì)胞CXCL16、ox-LDL表達(dá)，免疫組織化學(xué)SABC法檢測腎小球NF-κB表達(dá)，免疫熒光法檢測腎小球α3β1整合素表達(dá)，western blotting法檢測腎臟CXCL16和NF-κB表達(dá)，光鏡、電鏡觀察腎組織組織學(xué)改變。
　　結(jié)果;
　　1.各組小鼠體質(zhì)量、24h尿蛋白定量以及血清白蛋白、總膽固醇、ox-L

8、DL的變化
　　與正常對照組相比，阿霉素腎病組、辛伐他汀治療組小鼠體質(zhì)量、血清白蛋白明顯降低(P＜0.05)，而24h尿蛋白定量、血清TC以及ox-LDL水平明顯升高（P＜0.05）。與阿霉素腎病組相比，辛伐他汀治療組小鼠體質(zhì)量、血清白蛋白明顯升高(P＜0.05)，24h尿蛋白定量明顯降低(P＜0.05），而血清TC和ox-LDL水平則無明顯降低(P＞0.05)。（見圖1）
　　2.各組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化
　　光鏡下

9、，與正常對照組小鼠相比，阿霉素腎病組小鼠腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞中重度增生、球囊粘連以及局灶節(jié)段硬化。腎小管管腔節(jié)段性擴(kuò)張，血管管壁增厚，細(xì)胞核增多。辛伐他汀治療后系膜增生、系膜基質(zhì)增生明顯減輕，腎小管擴(kuò)張、血管管壁增厚減輕，但仍未完全恢復(fù)正常。與正常對照組相比，阿霉素腎病組與辛伐他汀治療組腎臟慢性指數(shù)（Chronicity Index，CI）明顯增加(P＜0.05)，但是應(yīng)用辛伐他汀治療后，CI明顯降低(P＜0.05)。電鏡下，正常對照組小

10、鼠腎小球基底膜均勻一致，足細(xì)胞及足突形態(tài)正常。阿霉素腎病組小鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)重度增生，基底膜彌漫增厚，足突廣泛融合。辛伐他汀治療后系膜增生、基底膜增厚以及足突融合明顯減輕，但仍未完全恢復(fù)正常。（見圖2，圖3）
　　3.各組小鼠血清IFN-γ、腎組織NF-κB的變化
　　與正常對照組相比，阿霉素腎病組、辛伐他汀治療組血清IFN-γ水平顯著升高(P＜0.05)，腎組織NF-κB表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。與阿霉素腎病組相

11、比，辛伐他汀治療組小鼠組血清IFN-γ水平、腎組織NF-κB表達(dá)水平有不同程度的減少(P＜0.05)。（見圖4）
　　4.各組小鼠腎小球足細(xì)胞CXCL16、ox-LDL表達(dá)的變化
　　與正常對照組相比，阿霉素腎病組、辛伐他汀治療組小鼠腎小球CXCL16、ox-LDL表達(dá)增加（P均＜0.05）;與阿霉素腎病組相比，辛伐他汀治療組CXCL16、ox-LDL表達(dá)水平有不同程度的下降（P均＜0.05），但仍未達(dá)到正常水平。進(jìn)一步通過

12、CXCL16、ox-LDL與Synaptopodin免疫熒光雙標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)CXCL16主要在足細(xì)胞細(xì)胞膜上表達(dá)，ox-LDL主要在足細(xì)胞細(xì)胞膜以及細(xì)胞漿中表達(dá)。（見圖5，圖6）
　　5.各組小鼠腎小球α3β1整合素表達(dá)水平的變化
　　與正常對照組相比，阿霉素腎病組、辛伐他汀治療組小鼠腎小球α3β1整合素表達(dá)水平下降(P＜0.05);與阿霉素腎病組相比，辛伐他汀治療組α3β1整合素表達(dá)水平上升(P＜0.05)，但仍未達(dá)到正常水平

13、。（見圖7）
　　結(jié)論
　　1.在阿霉素腎病發(fā)生發(fā)展過程中，CXCL16可作為足細(xì)胞攝取ox-LDL的清道夫受體，協(xié)助足細(xì)胞攝取ox-LDL，從而引起足細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷
　　2.足細(xì)胞上CXCL16介導(dǎo)ox-LDL進(jìn)入足細(xì)胞后，可能一方面通過激活NF-κB信號傳導(dǎo)通路，激活腎臟局部炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)炎癥因子介導(dǎo)的腎臟免疫損傷，進(jìn)而促進(jìn)腎病的發(fā)生發(fā)展;另一方面可能通過降低足細(xì)胞α3β1整合素表達(dá)水平，減弱足細(xì)胞與

14、基底膜的黏附，進(jìn)一步減少腎小球足細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)一步促進(jìn)腎小球硬化的進(jìn)展。
　　3.辛伐他汀可以不依賴其降血脂作用發(fā)揮對腎臟保護(hù)作用。
　　4.辛伐他汀的腎臟保護(hù)作用可能通過減少腎小球足細(xì)胞CXCL16的表達(dá)，進(jìn)而減少足細(xì)胞對ox-LDL的攝取，減輕足細(xì)胞脂質(zhì)沉積。脂質(zhì)沉積減輕后一方面可能通過抑制NF-κB信號通路激活，減輕腎臟局部炎癥反應(yīng)，減輕炎癥因子介導(dǎo)的免疫損傷，進(jìn)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用;另一方面可能通過增加足細(xì)胞α3β1整合