Pannexin1對(duì)LXR介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL的影響及分子機(jī)制的初探.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種由多種因素誘導(dǎo)的血管慢性炎癥疾病，在AS發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，泡沫細(xì)胞堆積形成脂質(zhì)條紋，最后發(fā)展形成脂質(zhì)斑塊。斑塊破裂后形成血栓堵塞血管，導(dǎo)致缺血性中風(fēng)或心肌梗死，嚴(yán)重威脅人類健康。AS的發(fā)生發(fā)展過程中，脂質(zhì)代謝紊亂是重要的環(huán)節(jié)。肝X受體（Liver X Receptor，LXR）激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞釋放腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphospha

2、te，ATP），且明顯減少AS斑塊的形成。但詳細(xì)的分子機(jī)制尚不明確。Pannexin1是六聚體形成的膜通道蛋白，其開放后可允許小分子通過，ATP即可經(jīng)由該通道釋放。但Pannexin1通道是否參與巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，從而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞未見報(bào)道。本研究檢測(cè)了 Pannexin1通道對(duì) LXR介導(dǎo) THP-1巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）作用，并初步對(duì)其分

3、子機(jī)制進(jìn)行了探討。該研究為深入研究AS發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的思路。
　　方法：
　　1.采用佛波酯（Phorbol12-myristate13-acetate，PMA）誘導(dǎo)人急性白血病單核細(xì)胞（THP-1）分化成為THP-1巨噬細(xì)胞，并經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及CD14 mRNA的表達(dá)的檢測(cè)對(duì)細(xì)胞分化是否成功進(jìn)行鑒定。
　　2.采用RT-PCR檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞中Pannexin1的mRNA的表達(dá)。
　　3.采用West

4、ern Blot技術(shù)檢測(cè)LXR激動(dòng)劑（GW3965）刺激前后THP-1巨噬細(xì)胞中LXRα和LXRβ的表達(dá)情況。
　　4.采用熒光顯微鏡觀察LXR激動(dòng)劑（GW3965）介導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞攝取Dil-ox-LDL。通過加入Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）前后觀察LXR激動(dòng)劑（GW3965）介導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞攝取Dil-ox-LDL的變化，使用圖像分析軟件（Image-pro plus v6.0）對(duì)熒光圖片進(jìn)行分析

5、，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)，用以衡量細(xì)胞攝取Dil-ox-LDL量的變化情況。
　　5.采用螢光素酶法以及 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)應(yīng)用Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）前后GW3965刺激細(xì)胞釋放ATP的變化情況以及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ATP-Binding Cassette Transporters A1，ABCA1）的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.THP-1細(xì)胞經(jīng)160nM PMA誘導(dǎo)分化24小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)

6、由分化前的圓形懸浮生長(zhǎng)變?yōu)樗笮?，并有大量的偽足出現(xiàn)，且呈貼壁生長(zhǎng)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，THP-1經(jīng)誘導(dǎo)分化為 THP-1巨噬細(xì)胞后，THP-1巨噬細(xì)胞中CD14 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，與THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)前相比有顯著性差異（p<0.001）。
　　2.Western Blot檢測(cè)顯示LXR激動(dòng)劑（GW3965）可以明顯誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞LXRα和LXRβ的表達(dá)。使用GW3965處理THP-1巨噬細(xì)胞前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義（p<0.001）。
　　3.THP-1巨噬細(xì)胞攝取Dil-ox-LDL結(jié)果顯示：以Pannexin1通道抑制劑10Panx1（200μM）預(yù)處理細(xì)胞30分鐘，再用GW3965刺激THP-1巨噬細(xì)胞4小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組可以減弱細(xì)胞對(duì)Dil-ox-LDL的攝取，與GW3965刺激組相比有顯著性差異（p<0.01）。
　　4.THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng) GW3965刺激不同時(shí)間（0min、5min、10min、20min、30m

8、in）后，GW3965刺激組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞釋放的ATP含量較對(duì)照組顯著增加（p<0.001），并且 GW3965刺激10分鐘時(shí)達(dá)到高峰；當(dāng)使用200μM的Pannexin1通道特異性抑制（10Panx1）預(yù)處理細(xì)胞30分鐘，檢測(cè)結(jié)果顯示 ATP的釋放量較 GW3965刺激組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。
　　5.RT-PCR檢測(cè)顯示LXR激動(dòng)劑（GW3965）可以誘導(dǎo)ABCA1的表達(dá)，當(dāng)使用200μM的Pannexin

9、1通道特異性抑制劑（10Panx1）預(yù)處理細(xì)胞30分鐘，可明顯地抑制 GW3965誘導(dǎo) ABCA1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）可抑制LXR激動(dòng)劑（GW3965）介導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞釋放ATP的過程。
　　2.Pannexin1通道抑制劑（10Panx1）對(duì)LXR激動(dòng)劑（GW3965）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL的能力起到抑制作用。