DAXX亞細(xì)胞定位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察DAXX的亞細(xì)胞定位對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡的影響，為開(kāi)辟以DAXX的亞細(xì)胞定位為手段，穩(wěn)定斑塊、防治急性冠脈綜合征的新途徑提供理論依據(jù)。
　　方法：構(gòu)建人源性DAXX胞核定位突變質(zhì)粒DAXX（S667A）、胞漿定位突變質(zhì)粒DAXX（W621A）；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)DAXX的表達(dá)情況和轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)，應(yīng)用免疫熒光法觀察DA

2、XX在細(xì)胞中的定位情況；轉(zhuǎn)染24h后用100μg/mL ox-LDL孵育48h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用 RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)ASKI和JNK的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：DAXX的兩個(gè)突變重組質(zhì)粒DAXX（S667A）和DAXX（W621A）經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測(cè)序分析，證實(shí)突變正確，無(wú)其它突變和讀碼框移位。RT-PCR和Western Blot

3、法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)DAXX表達(dá)的升高有顯著性差異，表明轉(zhuǎn)染效率達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。免疫熒光法觀察到DAXX（WT）在胞核胞漿均有表達(dá)，且主要定位于胞核；質(zhì)粒DAXX(S667A)定位胞核；質(zhì)粒DAXX(W621A)定位胞漿。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞經(jīng)100μg/ml ox-LDL孵育48h，與正常對(duì)照組比較，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn) DAXX(W621A)組細(xì)胞活性顯著下調(diào)，凋亡率明顯上升（p＜0.05）；轉(zhuǎn)DAXX(S667A)組細(xì)胞活