miR-663a對肝細胞癌生物學行為的影響及其分子機制的研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2015年我國肝癌新發(fā)病例及死亡病例分別估計為46.6萬人和42.2萬人，位列全部惡性腫瘤的第四位和第三位。由于90％以上的原發(fā)性肝癌為肝細胞癌，因此，不斷深入研究并發(fā)現(xiàn)肝細胞癌重要的分子標志物及關鍵生物治療靶點，對于提高肝細胞癌綜合療效具有重要的臨床意義。miR-663a位于人染色體20q11.1，其被報道與細胞分化，炎癥反應，自身免疫疾病及腫瘤形成等多種生物學行為的發(fā)生

2、密切相關。有報道m(xù)iR-663a作為一種抑癌基因，抑制骨髓瘤，腦神經膠質瘤，胰腺癌，急性白血病，結腸癌，胃癌及甲狀腺癌等多種實體腫瘤細胞的增殖，侵襲及克隆形成等生物學行為;同時也有研究發(fā)現(xiàn)miR-663a作為一種致癌基因，具有促進卵巢癌紫杉醇耐藥細胞，雄激素抵抗前列腺癌細胞，乳腺癌耐藥細胞，黑色素瘤細胞，鼻咽癌細胞及肺癌細胞的增殖能力。雖然有研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中存在大量發(fā)揮表觀調控作用的非編碼RNA表達異常，但miR-663a在肝細胞癌

3、中的表達情況及其作用目前尚不清楚?；趍iRNA具有保守性、時序性及組織特異性等特征，鑒于此，本研究擬探討miR-663a在肝細胞癌組織中的表達情況及其臨床意義、研究其對肝細胞癌細胞生物學行為的影響及其可能涉及的分子機制。
　　方法：
　　1、利用TCGA數(shù)據庫分析肝細胞癌組織中miR-663a表達水平與臨床病理學參數(shù)及預后的關系;通過qRT-PCR檢測肝細胞癌臨床樣本中miR-663a表達水平與臨床病理學參數(shù)的關系。2、構

4、建miR-663a過表達及沉默肝細胞癌細胞系:通過MTS法檢測miR-663a對肝細胞癌細胞增殖活力的影響;利用EdU及克隆形成實驗檢測miR-663a對肝細胞癌細胞增殖的影響;采用PI染色法檢測miR-663a對肝細胞癌細胞周期的影響;應用Transwell侵襲實驗檢測miR-663a對肝細胞癌細胞侵襲的影響;通過AnnexinⅤ-PI染色法檢測miR-663a對肝細胞癌細胞化療藥物敏感性的影響。3、運用生物信息學軟件預測miR-66

5、3a靶基因;采用雙熒光素酶報告基因實驗對miR-663a靶基因TGF-β1進行驗證;利用qRT-PCR及Western blot驗證miR-663a調控TGF-β1基因的表達;應用Transwell侵襲實驗證實miR-663a通過調控靶基因TGF-β1影響肝細胞癌細胞的侵襲能力;在肝細胞癌組織中通過qRT-PCR檢測miR-663a與靶基因TGF-β1的表達情況，并進一步利用Pearson分析二者表達相關情況。4、利用免疫熒光及West

6、ern blot方法觀察并檢測GOLPH3在肝細胞癌細胞的表達及分布情況;通過AnnexinⅤ-PI染色法檢測miR-663a對GOLPH3調控的肝細胞癌細胞化療藥物敏感性的作用。
　　結果：
　　1、miR-663a在肝細胞癌組織中的表達及其臨床意義的研究:(1)miR-663a在肝細胞癌組織的表達水平顯著低于其配對癌旁組織;(2)miR-663a在肝細胞癌組織的表達水平與腫瘤大小和數(shù)量密切相關，即miR-663a高表達的

7、肝細胞癌組織與miR-663a低表達的肝細胞癌組織相比:其腫瘤體積相對較小，腫瘤數(shù)目相對較少;(3)通過TCGA數(shù)據庫分析發(fā)現(xiàn)miR-663a高低表達組之間的總體生存時間沒有統(tǒng)計學差異，但miR-663a高表達組肝細胞癌患者的總體生存時間較miR-663a低表達組肝細胞癌患者的總體生存時間有延長趨勢。2、miR-663a與肝細胞癌細胞生物學行為的關系:(1)過表達miR-663a可以明顯抑制肝細胞癌細胞的增殖活性，減少肝細胞癌細胞G1期

8、比例，誘導肝細胞癌細胞停滯于S期，并同時降低肝細胞癌細胞的侵襲能力。(2)過表達miR-663a可增加化療藥物OXA和ADM誘導的肝細胞癌細胞的凋亡，增加細胞對OXA和ADM化療藥物的敏感性。3、miR-663a調控靶基因TGF-β1影響肝細胞癌細胞侵襲能力的機制研究:(1)miR-663a通過靶向調控TGF-β1，抑制TGF-β1基因的表達及肝細胞癌細胞的侵襲能力;(2)在肝細胞癌組織中miR-663a的表達普遍下降，TGF-β1的表

9、達總體增加，二者表達呈負相關。4、miR-663a對GOLPH3調控的肝細胞癌細胞化療藥物敏感性的作用:(1)GOLPH3主要表達于肝細胞癌細胞的胞漿中，且在細胞核中存在散在性分布;(2)在肝細胞癌細胞中，過表達GOLPH3抑制miR-663a的表達，沉默GOLPH3促進miR-663a的表達;(3)轉染miR-663a可增加化療藥物5-Fu和OXA誘導的過表達GOLPH3 Bel-7402和HepG2細胞凋亡，增加細胞對5-Fu和OX

10、A化療藥物的敏感性。
　　結論：
　　miR-663a在肝細胞癌組織中表達下調，其表達水平與患者腫瘤大小及數(shù)量密切相關;miR-663a的表達水平與肝細胞癌細胞的增殖能力，細胞周期，侵襲能力，細胞對化療藥物OXA及ADM的敏感性等作用密切相關;miR-663a通過調控靶基因TGF-β1影響肝細胞癌細胞的侵襲能力，其二者在肝細胞癌組織中表達呈負相關;在細胞核中呈散在分布的GOLPH3可能負性調控miR-663a的表達，進而參與