MicroRNA-182對(duì)漿液卵巢癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：MiR-182對(duì)瘦素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究
　　研究背景：
　　卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女健康，死亡率居?jì)D科腫瘤之首。早期診斷困難及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療手段缺乏，是卵巢癌高死亡率的主要原因。因此及早捕捉預(yù)警信號(hào)并闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)卵巢癌的防治至關(guān)重要，但目前相關(guān)機(jī)制尚未闡明。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明肥胖增加激素依賴性腫瘤（如卵巢癌）的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，瘦素(Leptin)作為重要的脂肪因子

2、類激素之一，參與調(diào)控機(jī)體的脂肪代謝，并與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌時(shí)瘦素水平升高，且與患者無病生存期密切相關(guān)，但目前瘦素與卵巢癌增殖、凋亡的關(guān)系及其在卵巢癌起源中的作用尚不明確。
　　MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯或者誘導(dǎo)降解抑制靶mRNA的功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡過程。研究表明多種腫瘤組織存在miRNAs的異常表達(dá)或者突變，并影響腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。MiR-182

3、是重要的miRNAs分子，其過表達(dá)于輸卵管內(nèi)上皮性漿液性卵巢癌和高級(jí)別漿液性卵巢癌，并促進(jìn)良性和惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)化，提示miR-182在卵巢癌的早期發(fā)生中具有重要意義，而對(duì)其進(jìn)行有效調(diào)節(jié)將有助于卵巢癌的防治。研究表明瘦素可通過影響miRNAs的表達(dá)調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但關(guān)于卵巢癌發(fā)生和發(fā)展過程中瘦素影響miRNAs表達(dá)及機(jī)制未見報(bào)道。
　　綜上所述，基于相關(guān)領(lǐng)域國內(nèi)外的研究進(jìn)展，本課題體外研究了瘦素通路下游信號(hào)分子STAT

4、5介導(dǎo)的miR-182上調(diào)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制。本研究肯定了瘦素和miR-182在卵巢癌中的作用，進(jìn)一步闡明了卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為卵巢癌的早期診斷和治療提供新的線索。
　　研究目的：
　　1.瘦素對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)化的作用。
　　2.探索介導(dǎo)瘦素調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)化的miRNAs及miR-182和miR-96在瘦素作用中的影響。
　　3.觀察瘦素下游信號(hào)通路對(duì)miR-182和m

5、iR-96的作用。
　　研究方法
　　1.卵巢癌細(xì)胞系瘦素及瘦素受體的表達(dá)
　　卵巢癌細(xì)胞(SKOV3和A2780)37℃培養(yǎng)24小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)瘦素和瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb和短型受體OB-Ra表達(dá)，Westernblot檢測(cè)瘦素及其受體的蛋白水平。培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清，ELISA法檢測(cè)內(nèi)源性瘦素表達(dá)。
　　2.瘦素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)化的影響
　　分別給予SKOV3和A2780細(xì)胞不同劑量瘦

6、素（0、10、50、100和500ng/mL），每隔24小時(shí)收集細(xì)胞，WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制生長(zhǎng)曲線。卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組，在0.3％的軟瓊脂中37℃培養(yǎng)3周后，結(jié)晶紫染色觀察不同組別軟瓊脂中形成的單細(xì)胞克隆數(shù)目。卵巢癌細(xì)胞分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組37

7、℃培養(yǎng)48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，瘦素處理的結(jié)腸癌細(xì)胞-HCT-116用于陽性對(duì)照。
　　3.瘦素作用后卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FOXO3表達(dá)的變化，并觀察其在瘦素調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用
　　卵巢癌細(xì)胞（SKOV3和A2780）分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，Westernblot檢測(cè)FOXO1和FOXO3蛋白水平變化，篩選

8、表達(dá)變化的FOXO分子，然后WesternBlot檢測(cè)其下游靶分子蛋白水平表達(dá)。
　　siRNA干擾相應(yīng)FOXO分子的表達(dá)，RT-PCR和WesternBlot分別從基因水平和蛋白水平檢測(cè)干擾效率，卵巢癌細(xì)胞分為Control、Leptin、Con-siRNA和FOXO-siRNA組，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，WST-1檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖變化。
　　4.瘦素對(duì)靶向作用于FOXO分子3'-UTR的miRNAs的影響，miRNAs在

9、卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用
　　PCR克隆擴(kuò)增FOXO分子的3'-UTR并構(gòu)建psiCHECK2熒光載體，用該載體及對(duì)照空載體分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞分為Vector、Vector+Leptin、FOXO-3'-UTR、FOXO-3'-UTR+Leptin組并繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同組別的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
　　卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780分為Control和Lepti

10、n組，培養(yǎng)48小時(shí)后，RT-PCR檢測(cè)miRNAs分子的基因水平表達(dá)變化。用所測(cè)miRNAs的mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)各組過表達(dá)效率，Westernblot檢測(cè)不同mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FOXO分子蛋白水平的變化，WST-1檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化。用miRNAs抑制劑轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)各組抑制效率，細(xì)胞分為Control、Leptin、Leptin+miRNAsinh

11、ibitor并繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，Westernblot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的FOXO分子蛋白水平的變化，WST-1檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化。
　　5.瘦素受體下游信號(hào)傳導(dǎo)分子STAT3、STAT5在瘦素調(diào)節(jié)的miRNAs表達(dá)上調(diào)中的作用
　　瘦素作用卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞48小時(shí)后，Westernblot檢測(cè)瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb表達(dá)水平的變化。
　　瘦素處理卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞不同時(shí)間（0，15，30，60

12、分鐘）后，Westernblot檢測(cè)不同STAT信號(hào)通路蛋白(STAT3、STAT5)的表達(dá)變化。
　　卵巢癌SKOV3和A278048細(xì)胞分為Control、Leptin、STAT5-siRNA、CucurbitacinⅠ(p-STAT3抑制劑)、Leptin+STAT5-siRNA、Leptin+CucurbitacinⅠ組，RT-PCR檢測(cè)目的miRNAs分子基因表達(dá)水平變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.卵巢癌細(xì)胞

13、表達(dá)瘦素受體
　　實(shí)驗(yàn)表明，卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞在蛋白水平和mRNA水平均可檢測(cè)到瘦素、瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb和短型受體OB-Ra的表達(dá)，兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清中也存在極低量的瘦素（分別為38.39±3.72pg/mL和35.40±2.44pg/mL），因遠(yuǎn)低于生理劑量，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均給予外源性瘦素。
　　2.瘦素促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化能力
　　瘦素以劑量依賴和時(shí)間依賴方式促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的增

14、殖能力（P＜0.05）。同時(shí)增加軟瓊脂中兩種卵巢癌細(xì)胞克隆的數(shù)目和大?。⊿KOV3細(xì)胞:2.72±0.34倍，P＜0.05;A2780細(xì)胞:1.97±0.15倍，P＜0.05），瘦素抗體可阻斷瘦素的促細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。流式細(xì)胞術(shù)顯示瘦素不影響卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的凋亡率（P＞0.05），但顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的凋亡(P=0.0169)。
　　3.瘦素抑制卵巢癌細(xì)胞FOXO3的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖
　　W

15、esternblot結(jié)果表明瘦素（100ng/ml）顯著抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780內(nèi)FOXO3的表達(dá)(SKOV3細(xì)胞:55.1±1.8％，P＜0.01;A2780細(xì)胞:48.4±10.1％，P＜0.01)，F(xiàn)OXO1的表達(dá)無顯著變化(P＞0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瘦素(100ng/ml)顯著抑制細(xì)胞內(nèi)FOXO3的兩個(gè)下游靶基因Bim（SKOV3細(xì)胞:45.8±1.5％，P＜0.01;A2780細(xì)胞:46.7±3.6％，P＜0.

16、01）和p27（SKOV3細(xì)胞:41.4±6.3％，P＜0.01;A2780細(xì)胞:36.7±9.0％，P＜0.01）的表達(dá)。利用FOXO3-siRNA干擾掉細(xì)胞內(nèi)FOXO3基因和蛋白表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的增殖能力均顯著增強(qiáng)（SKOV3細(xì)胞:1.63±0.10倍，P＜0.01;A2780細(xì)胞:1.59±0.16倍，P＜0.05）。
　　4.瘦素通過上調(diào)靶向作用于FOXO33'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的miRNAs抑制FOXO3表達(dá)

17、，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖
　　利用包含F(xiàn)OXO33'-UTR的psiCHECK2熒光載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，雙熒光報(bào)告系統(tǒng)顯示瘦素(100ng/ml)顯著降低卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780內(nèi)的熒光素酶強(qiáng)度（SKOV3細(xì)胞:53.4±2.5％，P=0.001;A2780細(xì)胞:41.6±8.5％，P=0.016）。RT-PCR結(jié)果顯示瘦素(100ng/ml)顯著上調(diào)SKOV3細(xì)胞中靶向作用于FOXO3的腫瘤相關(guān)miRNAs，包括miR-18

18、2（2.26±0.23倍，P＜0.01）、miR-106（1.52±0.16倍，P=0.03）、miR-96（1.91±0.03倍，P＜0.01）和miR-155（1.53±0.10倍，P=0.01），對(duì)A2780細(xì)胞中的上述miRNAs具有相似的作用。但兩種細(xì)胞miR-93和miR-153的表達(dá)均不受瘦素影響（P＞0.05）。
　　上述六種miRNAs的mimics分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780，Westernblot

19、顯示miR-182(SKOV3細(xì)胞:64.8％±11.4％，P＜0.05;A2780細(xì)胞:51.8％±0.5％，P＜0.05)和miR-96(SKOV3細(xì)胞:58.3％±2.5％，P＜0.05;A2780細(xì)胞:42.2％±4.1％，P＜0.05)兩種mimics可以有效抑制兩種細(xì)胞內(nèi)FOXO3的表達(dá)，miR-155和miR-106a的mimics則不具備此功能(P＞0.05)。利用抑制劑干擾阻斷兩種細(xì)胞內(nèi)miR-182和miR-96的表

20、達(dá)后，Leptin對(duì)FOXO3表達(dá)的抑制作用亦消失。WST-1檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖發(fā)現(xiàn)，miR-182（SKOV3細(xì)胞:2.65±0.05倍，P＜0.01;A2780細(xì)胞:2.52±0.06倍，P＜0.01）和miR-96（SKOV3細(xì)胞:2.03±0.08倍，P＜0.01;A2780細(xì)胞:1.85±0.13倍，P＜0.05）的mimics可促進(jìn)兩種細(xì)胞的增殖，而miR-182（SKOV3細(xì)胞:37.1％±3.3％，P＜0.01;A278

21、0細(xì)胞:37.4％±5.0％，P＜0.01）和miR-96(SKOV3細(xì)胞:28.9％±6.2％，P＜0.01;A2780細(xì)胞:29.9％±3.5％，P＜0.01)抑制劑則可有效抑制瘦素對(duì)兩種細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。
　　5.瘦素通過STAT5通路上調(diào)細(xì)胞中miR-182和miR-96的表達(dá)
　　瘦素（100ng/ml）能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb的表達(dá)。同時(shí)瘦素可活化瘦素受體下游信號(hào)通路STAT

22、3和STAT5，分別在60、30分鐘活化達(dá)到高峰，特異性阻斷兩個(gè)通路發(fā)現(xiàn)cucurbitacinⅠ（STAT3抑制劑）不影響瘦素誘導(dǎo)的miR-182和miR-96表達(dá)上調(diào)(P＞0.05)，而STAT5-siRNA能夠降低瘦素導(dǎo)致的miR-182(SKOV3細(xì)胞:43.5％±2.5％，P＜0.01;A2780細(xì)胞:32.0％±9.4％，P＜0.01)和miR-96(SKOV3細(xì)胞:34.1％±0.8％，P＜0.01;A2780細(xì)胞:22.

23、7％±4.2％，P＜0.05)表達(dá)上調(diào)，表明STAT5通路參與miR-182和miR-96依賴的FOXO3抑制和細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論：
　　1.MiR-182和miR-96在瘦素抑制FOXO3表達(dá)、進(jìn)而促進(jìn)抑卵巢癌細(xì)胞增殖這一過程中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用。
　　2.瘦素通過下游STAT5信號(hào)途徑上調(diào)卵巢癌細(xì)胞miR-182和miR-96的表達(dá)。
　　第二部分：抗miR-182化合物對(duì)卵巢癌體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研

24、究
　　研究背景：
　　卵巢癌是女性死亡率最高的生殖系統(tǒng)腫瘤，高級(jí)別漿液性卵巢癌是卵巢癌中侵襲程度最高的類型，多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，腫瘤已出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)有的手術(shù)治療和化療可在一定程度上減少腫瘤負(fù)荷，但對(duì)患者遠(yuǎn)期生存率并無顯著影響。近年來抗microRNA治療(anti-microRNA)成為癌癥治療的一種潛在有效的途徑。miRNAs為一種小分子非編碼RNA，某些miRNAs與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中miR

25、-182是一種原癌miRNAs，可負(fù)性調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)有關(guān)的抑癌基因，從而促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　研究表明miR-182過表達(dá)與高級(jí)別漿液性卵巢癌，與腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲密切相關(guān)，且與患者的不良預(yù)后有關(guān)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)miR-182在瘦素介導(dǎo)的促卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此在miR-182過表達(dá)的卵巢癌中，anti-miR-182治療可能會(huì)減少腫瘤負(fù)荷、抑制侵襲轉(zhuǎn)移。綜上所述，基于本課題國內(nèi)外

26、的研究進(jìn)展及課題組的前期工作基礎(chǔ)，本課題組首次嘗試應(yīng)用anti-miR-182進(jìn)行卵巢癌治療。我們將人卵巢癌細(xì)胞固定植入小鼠卵巢包膜內(nèi)，成功構(gòu)建了小鼠原位卵巢癌模型，并給予小鼠anti-miR-182系統(tǒng)治療，應(yīng)用在體生物光學(xué)成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移，治療結(jié)束后用組織病理學(xué)手段確認(rèn)了腫瘤在小鼠各臟器的侵襲轉(zhuǎn)移情況及藥物的作用，并進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織中miR-182靶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分子生物學(xué)分析。本研究為侵襲性高級(jí)別漿液性卵巢癌提

27、供了一種潛在的新的治療手段。
　　研究目的：
　　1.模擬人卵巢癌構(gòu)建小鼠原位卵巢癌模型。
　　2.給與小鼠anti-miR-182治療，動(dòng)態(tài)觀察藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的影響。
　　3.組織學(xué)觀察藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　4.分析anti-miR-182影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.體外檢測(cè)anti-miR-182對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響
　　體外實(shí)驗(yàn)利用人卵巢

28、癌細(xì)胞系OVCAR3、HEY和SKOV3細(xì)胞，應(yīng)用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建miR-182穩(wěn)定過表達(dá)的HEY和SKOV3細(xì)胞系。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將anti-miR-182瞬時(shí)導(dǎo)入上述卵巢癌細(xì)胞系，細(xì)胞分為Control、anti-miR-182組，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-182的基因水平，Westernblot檢測(cè)miR-182靶基因的蛋白水平。
　　將anti-miR-182利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞OVC

29、AR3、HEY和SKOV3，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，1）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的變化;2）將Control細(xì)胞和anti-miR-182分別種在5個(gè)96孔板上（2×103每孔，每種細(xì)胞每板5個(gè)復(fù)孔），利用WST-1連續(xù)五天每天檢測(cè)細(xì)胞的增殖并繪制生長(zhǎng)曲線;3）軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞非停泊性生長(zhǎng)能力的變化。
　　2.構(gòu)建裸鼠原位人卵巢癌模型
　　利用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將熒光素酶基因?qū)敕€(wěn)定過表

30、達(dá)miR-182的SKOV3卵巢癌細(xì)胞(SKOV3-miR-182-1uc)，該熒光素酶與底物作用后可被在體生物光學(xué)成像系統(tǒng)檢測(cè)(IVIS)。
　　SKOV3-miR-182-1uc消化計(jì)數(shù)后，利用Ⅳ型膠原將腫瘤細(xì)胞（106個(gè)細(xì)胞）固定成直徑約0.2厘米的球狀小團(tuán)，顯微鏡下手術(shù)將細(xì)胞團(tuán)塊植入8周齡裸鼠左側(cè)卵巢包膜內(nèi)。
　　3.Anti-miR-182治療
　　術(shù)后小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（20只）和anti-miR-182實(shí)

31、驗(yàn)組（20只），并于術(shù)后第三天分別腹腔注射安慰劑或anti-miR-182(25mg/kg)，每周兩次，整個(gè)治療周期為8周（其中實(shí)驗(yàn)組4只動(dòng)物僅治療1周）。
　　4.Anti-miR-182對(duì)卵巢原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的影響
　　治療期間每周一次應(yīng)用IVIS技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲，利用軟件定量分析兩組動(dòng)物腫瘤信號(hào)強(qiáng)度。
　　8周后處死小鼠，測(cè)量對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤實(shí)際長(zhǎng)短徑線，收集冰凍所有小鼠血清和部分腫瘤、肝

32、臟組織，切除小鼠所有器官（肝、腎、脾、胰腺、腸道組織、子宮輸卵管、卵巢腫瘤及對(duì)側(cè)卵巢、肺、心臟）并固定備用。
　　ELISA檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清中CA125的水平。提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織總RNA，RT-PCR檢測(cè)兩組腫瘤組織內(nèi)與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或細(xì)胞死亡有關(guān)(CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、CHEK2)的基因表達(dá)水平。
　　5.Anti-miR-182對(duì)卵巢腫瘤侵襲遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響
　　IVIS技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)照

33、組和實(shí)驗(yàn)組原發(fā)瘤的轉(zhuǎn)移信號(hào)。對(duì)兩組動(dòng)物所有器官進(jìn)行組織切片和HE染色，顯微鏡下觀察個(gè)臟器轉(zhuǎn)移瘤的情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　6.腫瘤組織的分子生物學(xué)水平分析
　　提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腫瘤及血清中的總RNA，RT和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤即血清中miR-182及其同一基因簇miR-183和miR-96的基因表達(dá)。提取兩組動(dòng)物腫瘤組織內(nèi)的總蛋白，Westernblot檢測(cè)兩組腫瘤組織內(nèi)miR-182靶基因(BRCA1、MTSS1、

34、FOXO3)和誘導(dǎo)基因HMGA2的蛋白水平變化。
　　7.Anti-miR-182治療對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響
　　對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織切片和HE染色，鏡下觀察腫瘤與卵巢、輸卵管和卵巢周圍脂肪組織的關(guān)系，免疫組織化學(xué)染色確定腫瘤周圍微環(huán)境中的細(xì)胞成分。炎癥基因芯片技術(shù)觀察兩組腫瘤組織內(nèi)炎癥基因譜的變化。RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（各8例）腫瘤內(nèi)趨化因子和細(xì)胞因子（CCL2、IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ）的基因

35、水平變化。
　　人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3分為Control組、anti-miR-182組、miR-182過表達(dá)組、miR-182過表達(dá)+anti-miR-182組，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CCL2基因水平的變化。
　　8.藥物毒性分析
　　8周治療結(jié)束后，收集對(duì)照組和anti-miR-182實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的全部器官（肝臟、胰腺、胃腸道、腎、脾及子宮）并進(jìn)行組織切片和HE染色，鏡下觀察兩組組織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變

36、化，判斷藥物的毒性作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.Anti-miR-182抑制體外卵巢癌細(xì)胞的增殖、基質(zhì)膠侵襲和轉(zhuǎn)化能力
　　RT-PCR結(jié)果顯示anti-miR-182顯著抑制OVCAR3、HEY-miR-182和SKOV3-miR-182細(xì)胞內(nèi)miR-182的基因水平(P＜0.001)。Westernblot結(jié)果顯示，anti-miR-182顯著上調(diào)SKOV3-miR-182細(xì)胞內(nèi)miR-182靶基因FOXO3（1

37、.47±0.18倍，P＜0.05）、BRCA1（3.09±0.99倍，P＜0.05）、和MTSS1（1.39±0.18倍，P＜0.05）的蛋白水平，同時(shí)下調(diào)miR-182誘導(dǎo)的HMGA2（62.6％±17.2％，P＜0.01）的蛋白表達(dá)，對(duì)OVCAR3和HEY-miR-182細(xì)胞具有相似效應(yīng)。
　　基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示anti-miR-182可顯著抑制SKOV3-miR-182細(xì)胞的侵襲能力（抑制率57.1％±7.9％，P＜0.

38、001）。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明anti-miR-182可顯著減少單細(xì)胞克隆形成數(shù)目和大?。ㄒ种坡?4.8％±16.3％，P＜0.01）。WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示anti-miR-182抑制SKOV3-miR-182細(xì)胞的體外增殖（第3天，P＜0.05;第四天P＜0.05;第五天P＜0.01）。
　　2.構(gòu)建裸鼠原位人卵巢癌模型
　　將SKOV3-miR-182-1uc細(xì)胞包埋入Ⅳ型膠原并植入裸鼠左側(cè)卵巢包膜內(nèi)，術(shù)后第

39、二天，IVIS檢測(cè)結(jié)果表明所有小鼠熒光信號(hào)相同(相對(duì)熒光強(qiáng)度3-3.5×109)，表明卵巢癌細(xì)胞植入量在所有動(dòng)物體內(nèi)基本一致，無腹腔泄漏。
　　3.Anti-miR-182治療抑制卵巢癌腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)
　　術(shù)后第3天，小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組和anti-miR-182實(shí)驗(yàn)組并分別給予安慰劑或anti-miR-182腹腔注射治療，治療劑量25mg/kg，一周兩次，整個(gè)療程為8周。IVIS圖像顯示從治療第5周開始，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤

40、大小之間開始出現(xiàn)差異（對(duì)照組信號(hào)強(qiáng)度為（17.73±7.72）×109，實(shí)驗(yàn)組信號(hào)強(qiáng)度為（5.20±6.63）×109，P＜0.01），且該差異隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)而增大。
　　處死小鼠測(cè)量?jī)山M小鼠卵巢腫瘤實(shí)際大小發(fā)現(xiàn)表明anti-miR-182治療組的腫瘤(5.42±1.00mm，90.59±37.31mm3)顯著小于對(duì)照組(8.07±1.74mm，310.89±187.12mm3)，其最長(zhǎng)徑線較對(duì)照組減少38％，體積較對(duì)照組減少7

41、0.9％(P＜0.01)。ELISA結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠血清CA125水平高于實(shí)驗(yàn)組小鼠(P=0.06)。
　　RT-實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，anti-miR-182顯著上調(diào)腫瘤組織內(nèi)與細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡有關(guān)的miR-182假定靶基因CDKN1A(P=0.0199)、CDKN1B（P=0.0156）、FOXO1(P＜0.0001)、CHEK2(P＜0.0001)。
　　4.Anti-miR-182治療抑制小鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和

42、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移
　　治療第8周IVIS圖像顯示，對(duì)照組腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為28％(5/8)，實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)移率為7％(1/15)。組織學(xué)分析結(jié)果顯示對(duì)照組77.8％(14/18)的動(dòng)物存在至少一處轉(zhuǎn)移癌灶，實(shí)驗(yàn)組33.3％(5/15)的動(dòng)物存在至少一處轉(zhuǎn)移灶;對(duì)照組共發(fā)現(xiàn)31個(gè)轉(zhuǎn)移瘤，實(shí)驗(yàn)組僅發(fā)現(xiàn)6個(gè)轉(zhuǎn)移瘤。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目由多到少的部位是依次是脾臟（對(duì)照組陽性率為44％，8/18;

43、實(shí)驗(yàn)組陽性率為20％，3/15）、大網(wǎng)膜(對(duì)照組陽性率為28％，5/18;實(shí)驗(yàn)組陽性率為13％，2/15)、胰腺（對(duì)照組陽性率為22％，4/18;實(shí)驗(yàn)組陽性率為0％）、和肝臟（對(duì)照組陽性率為11％，2/18;實(shí)驗(yàn)組陽性率為0％）。與其他部位的轉(zhuǎn)移瘤相比，胰腺轉(zhuǎn)移瘤更大、侵襲性更強(qiáng)。對(duì)照組有一只小鼠發(fā)生了對(duì)側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移。雖然腎實(shí)質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤，對(duì)照組50％(9/18)的動(dòng)物的卵巢腫瘤與同側(cè)發(fā)生腎粘連，而anti-miR-182治療組動(dòng)物未

44、發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象(0/15)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶。
　　5.Anti-miR-182治療后腫瘤組織的分子生物學(xué)分析
　　實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示與對(duì)照組腫瘤相比，anti-miR-182治療組的腫瘤組織內(nèi)miR-182表達(dá)水平極低（降低94.9％±13.3％）或低于測(cè)量范圍(P＜0.001)，同時(shí)顯著降低miR-183的表達(dá)（降低92.5％±9.7％，P＜0.001），但對(duì)miR-96的表達(dá)無影響（P＞0.05）。小

45、鼠血清內(nèi)miR-182（降低53.2％±10.4％，P＜0.01）和miR-183（降低84.3％±20.6％，P＜0.01）的水平也顯著降低。
　　Westernblot結(jié)果顯示經(jīng)anti-miR-182治療后腫瘤內(nèi)miR-182的靶基因BRCA1（2.63±0.35倍，P＜0.01）、FOXO3（1.42±0.18倍，P＜0.01）和MTSS1（2.63±1.29倍，P＜0.01）與對(duì)照組相比顯著上調(diào)，而miR-182誘導(dǎo)的基

46、因HMGA2表達(dá)下調(diào)（降低71.5％±4.0％，P＜0.01）。
　　6.Anti-miR-182治療誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制腫瘤的侵襲
　　組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)anti-miR-182治療組73.3％(11/15)的小鼠腫瘤細(xì)胞植入部位（卵巢旁軟組織）有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組雖有16.7％(3/18)的動(dòng)物存在單核細(xì)胞浸潤(rùn)，但單核細(xì)胞數(shù)量明顯少于實(shí)驗(yàn)組。免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了浸潤(rùn)細(xì)胞為KP1陽性小鼠單核細(xì)胞。單核細(xì)胞浸潤(rùn)少的腫瘤表現(xiàn)

47、出浸潤(rùn)生長(zhǎng)模式，并穿透卵巢包膜侵入周圍脂肪組織，而周圍有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤則局限于卵巢包膜內(nèi)。
　　炎癥基因譜分析顯示對(duì)照組腫瘤與anti-miR-182治療組腫瘤組織炎癥基因譜發(fā)生改變。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)CCL2(P＜0.0001)、IL-6(P=0.0019)、IL-8(P=0.0002)、TNF-α(P=0.0088)、IFN-γ（P＜0.0001）的表達(dá)顯著上調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)表明，無論在初

48、始SKOV3細(xì)胞還是SKOV3-miR-182細(xì)胞，anti-miR-182均可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)CCL2的基因表達(dá)（SKOV3細(xì)胞:3.60±0.73倍，P＜0.001;SKOV3-miR-182細(xì)胞:11.39±0.21倍，P＜0.001）。
　　7.Anti-miR-182治療對(duì)小鼠無明顯不良組織毒性作用
　　組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)8周anti-miR-182治療后，小鼠的肝臟、胰腺、胃腸道、腎、脾及子宮均無顯著的組織學(xué)和細(xì)