APE1-Ref-1基因與卵巢癌生物學行為的相關(guān)性及作用機制的初步研究.pdf

1、研究背景
　　卵巢癌是女性生殖器系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，但死亡率卻居第一位[1,2]。由于卵巢癌發(fā)病隱匿，且缺乏有效的早期診斷措施，大多數(shù)患者首次確診時已到中晚期。加之卵巢癌易出現(xiàn)化療耐藥及復發(fā)轉(zhuǎn)移，盡管手術(shù)+綜合化療的治療方法已經(jīng)日趨成熟，但是患者預后差，五年生存率仍然較低[3]。因此，更好的研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展及細胞耐藥的分子機制，包括尋找與其密切相關(guān)的靶基因，對卵巢癌的早期診斷及有效治療有著十

2、分重要的臨床價值。
　　APE1/Ref-1（脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子）是近年來在腫瘤研究方面受到較多關(guān)注的一個基因。APE1/Ref-1是一種在細胞生命過程中扮演重要角色的多功能蛋白[4]。它不僅作為堿基切除修復途徑中重要限速酶參與DNA修復過程，而且通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原活性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。另外，APE1/Ref-1與細胞凋亡、氧化信號傳遞及細胞周期的調(diào)控密切關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，APE1/Ref-1在多種正常

3、組織中廣泛表達，在宮頸癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、小細胞肺癌等腫瘤組織中表達升高或者亞定位改變。APE1/Ref-1是腫瘤及其相應(yīng)正常組織間的差異表達基因，因此推測該基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可能是潛在的癌基因。另一方面，鑒于APE1在DNA修復及細胞凋亡過程中的重要作用，我們推測APE1有可能參與了腫瘤細胞的化療耐受，很有可能成為潛在的腫瘤治療靶點。
　　研究目的
　　1.從組織水平研究APE1/Ref-1的表達與卵巢癌臨床病理特征

4、、血管生成及細胞增殖方面的關(guān)系，揭示其在卵巢癌發(fā)生、演進、血管生成中的功能。
　　2.從細胞水平研究APE1/Ref-1對卵巢癌細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響，進一步揭示APE1/Ref-1在卵巢癌發(fā)生、演進中的作用及分子機制；為將來以APE1/Ref-1為靶點的卵巢癌基因治療提供理論依據(jù)。
　　3.從細胞水平研究PE1/Ref-1對卵巢癌順鉑耐藥的影響，并初步探討可能機制。為下一步以APE1/Ref-1為靶點逆轉(zhuǎn)

5、卵巢癌耐藥的研究奠定基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容
　　1.APE1/Ref-1表達與卵巢癌臨床病理學特征、血管生成以及細胞增殖間的關(guān)系
　　a)運用免疫組織化學技術(shù)檢測APE1/Ref-1在65例卵巢癌石蠟標本組織中的表達、分析其與臨床病理因素間的關(guān)系。運用WesternBlot及定量PCR技術(shù)檢測36例卵巢癌新鮮標本中APE1/Ref-1的表達。
　　b)運用免疫組織化學技術(shù)檢測APE1/Ref-1、PCNA、CD34

6、在65例卵巢癌石蠟標本組織中的表達、分析APE1/Ref-1與增殖指數(shù)及血管形成間的關(guān)系。
　　2.APE1/Ref-1對卵巢癌細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響
　　a)運用Westernblot及半定量PCR法檢測五株卵巢癌細胞中APE1/Ref-1的表達；運用免疫熒光法檢測HO-8910細胞中APE1/Ref-1蛋白的亞細胞定位。
　　b)運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將帶有綠色熒光蛋白的APE1/Ref-1全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

7、卵巢癌HO-8910細胞，熒光顯微鏡下觀察瞬轉(zhuǎn)效率。
　　c)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APE1/Ref-1全長質(zhì)粒及空載體的HO-8910細胞株。熒光顯微鏡、Westernblot及半定量PCR檢測靶基因的表達。
　　d)運用MTT、平板克隆形成實驗及FCM法檢測APE1/Ref-1對HO-8910細胞增殖能力的影響。運用粘附實驗、劃痕實驗及侵襲實驗檢測APE1/Ref-1對HO-8910細胞粘附、遷移及侵襲能力的影響。

8、　　e)Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染前后AKt、p-AKt、CyclinD1、MMP2及E-cadherin蛋白的表達。
　　3.APE1/Ref-1對卵巢癌順鉑耐藥的影響及可能機制
　　a)運用MTT法及FCM法檢測順鉑作用后，APE1/Ref-1對HO-8910細胞增殖及凋亡的影響。
　　b)Westernblot法檢測順鉑誘導HO-8910細胞凋亡過程中Caspase4、8、9蛋白的活化情況。
　　c)

9、FCM法、Westernblot法檢測APE1/Ref-1對HO-8910細胞線粒體凋亡通路的影響。運用針對性試劑盒檢測線粒體膜電位的變化及細胞內(nèi)ATP水平變化，Westernblot法檢測線粒體凋亡通路蛋白細胞色素C、Bcl-2、Bax及cleavedcaspase3蛋白的表達情況。
　　研究結(jié)果
　　1.APE1/Ref-1表達與卵巢癌臨床病理學特征、血管生成以及細胞增殖間的關(guān)系
　　a)在65例卵巢癌組織中，58

10、例（89.23％）呈APE1陽性表達，7例（10.77％）呈APE1陰性表達；45例(69.23％)中APE1蛋白呈高表達（III+IV），20例(30.77％)呈低表達或不表達（I+II）。表達形式多為漿表達或者核漿共表達，單純的核表達較少見。
　　b)在卵巢癌組織中，APE1蛋白表達水平與年齡、家族史、腫瘤大小、病理分型及腹水無關(guān)(P>0.05)；與分化程度、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)：高分化腫瘤APE1蛋白

11、表達水平低于中低分化腫瘤；FIGO分期中，中晚期卵巢癌中APE1蛋白表達水平顯著高于早期卵巢癌；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌中APE1蛋白表達水平也高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌。
　　c)在65例卵巢癌標本中有39例（60％）呈現(xiàn)PCNA高表達（>40％），陽性率從6.9-95.6％不等。表達形式為核表達。在APE1蛋白高表達（III+IV）的卵巢癌組織中PCNA指數(shù)為53.5±2.3，而在APE1蛋白低表達（I+II）組中僅為18.6±3.

12、0，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在APE1蛋白陽性表達的卵巢癌組織中PCNA指數(shù)為40.3±4.1，而在APE1蛋白陰性表達組中僅為12.1±2.6，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　d)在APE1蛋白高表達（III+IV）的卵巢癌組織中MVD為50.7±6.5，而在APE1蛋白低表達（I+II）組中僅為23.6±3.0，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在APE1蛋白陽性表達的卵巢癌組織中MVD為39.3±4.

13、1，而在APE1蛋白陰性表達組中僅為20.1±3.5.，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　e)36例卵巢癌臨床標本W(wǎng)esternBlot檢測結(jié)果：隨著分化程度升高APE1蛋白表達水平降低；隨著FIGO分期增高，APE1蛋白表達水平增高。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組APE1蛋白的表達含量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。該結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本一致。
　　f)36例卵巢癌臨床標本定量PCR檢測結(jié)果：APE1與卵巢癌組織分化、FIGO分級及淋巴結(jié)

14、轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05）；而與年齡、家族史、腫瘤大小、病理分型及有無腹水無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。該實驗結(jié)果與免疫組化及WesternBlot的結(jié)果基本一致。
　　2.APE1/Ref-1對卵巢癌細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響
　　a)Westernblot及半定量PCR方法對五株卵巢癌細胞檢測結(jié)果：APE1蛋白在五株細胞中均有表達。表達含量在SKOV3、CP70、A2780、8910PM、HO-8910呈遞減趨勢。

15、半定量PCR檢測結(jié)果與Western-Blot檢測結(jié)果基本一致。
　　b)免疫熒光檢測結(jié)果：卵巢癌HO-8910細胞系中，幾乎所有的細胞均為核漿共表達。
　　c)HO-8910細胞轉(zhuǎn)染APE1全長質(zhì)粒48小時后，熒光顯微鏡下可見：細胞變圓，部分細胞散發(fā)強弱不一綠色熒光，初步判該質(zhì)粒斷瞬時轉(zhuǎn)染效率為50-60％。G418篩選9天，HO-8910組細胞全部死亡，APE1轉(zhuǎn)染組及空載體組大部分細胞死亡，少數(shù)有抗性細胞存活。繼續(xù)篩選

16、，兩組可見抗性克隆形成；熒光顯微鏡下判斷穩(wěn)轉(zhuǎn)效率約為95％。
　　d)Westernblot及半定量PCR檢測結(jié)果：正常HO-8910細胞及空載體組APE1mRNA表達水平較低，而APE1轉(zhuǎn)染組細胞APE1mRNA表達水平顯著增高。Westernblot結(jié)果與半定量PCR結(jié)果基本一致。
　　e)生長曲線結(jié)果：APE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞與空載體組和HO-8910組細胞相比，生長曲線上升快，而空載體組與HO-8910組細胞生長特性基

17、本一致?？寺∮嫈?shù)結(jié)果：轉(zhuǎn)染APE1質(zhì)粒組細胞克隆數(shù)較空載體組及HO-8910組明顯增高（P<0.05）。三組克隆形成率分別為：40％、38％、61％。流式法檢測細胞周期結(jié)果：與HO-8910組及空載體組細胞相比，APE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組G1期細胞比例減少，而G2+S期細胞比例增大。轉(zhuǎn)染組增殖指數(shù)（PI）與HO-8910組和空載體組相比分別升高了12.1％，10.9％。
　　f)MTT比色法檢測A490nm各組細胞光吸收值，評價粘附能力，

18、計算粘附率。結(jié)果：APE1轉(zhuǎn)染組細胞OD值高于HO-8910組及空載體組，APE1轉(zhuǎn)染組細胞對細胞外基質(zhì)（Matrigel）的粘附能力顯著高于其他兩組（P<0.05）。劃痕實驗結(jié)果：HO-8910組細胞、空載體組及APE1轉(zhuǎn)染組24小時遷移細胞個數(shù)分別為20.7±3.16、19.6±2.21、21.3±3.51，差異不具有顯著性(P>0.05)。侵襲小室結(jié)果：空載體組與HO-8910組的穿膜細胞數(shù)相當，APE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組穿過膜的細胞個數(shù)

19、明顯高于HO-8910組細胞及空載體組細胞(P<0.05)。
　　g)WesternBlot檢測相關(guān)的蛋白結(jié)果：HO-8910組與空載體組磷酸化AKt及CyclinD1蛋白表達量基本一致，APE1轉(zhuǎn)染組細胞中磷酸化AKt及CyclinD1蛋白表達較HO-8910組及空載體組顯著升高，而三組總的AKt蛋白表達量沒有改變。HO-8910組與空載體組MMP2及E-cadherin蛋白表達量基本一致，APE1轉(zhuǎn)染組細胞中MMP2及E-ca

20、dherin蛋白表達量較HO-8910組及空載體組顯著升高。
　　3.APE1/Ref-1對卵巢癌順鉑耐藥的影響及可能機制
　　a)MTT結(jié)果：在相同濃度的順鉑作用下，HO-8910組和空載體組細胞抑制率無顯著差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染組細胞抑制率明顯低于空載體組(P<0.05)。IC50結(jié)果：HO-8910組IC50值為22.12μM，,空載體組IC50值為19.84μM，轉(zhuǎn)染組升高為29.86μM。
　　b)流式檢

21、測凋亡結(jié)果：順鉑作用后，HO-8910細胞的凋亡率從4.5±0.6％上升到了74.6±8.1％。說明順鉑對HO-8910細胞的殺傷作用顯著?？蛰d體+DDP組與HO-8910+DDP組細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)。但是在APE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），僅為63.0±7.1％。與空載體+DDP組相比，APE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+DDP組細胞凋亡率下降了13.1％。
　　c)WesternBlot法檢測三種蛋白的剪

22、切激活情況（即檢測cleavedcaspase-4、8、9三種蛋白表達水平的變化），結(jié)果：順鉑作用12小時出現(xiàn)明顯的cleavedcaspase-4及cleavedcaspase-9的蛋白表達，而cleavedcaspase-8蛋白無明顯表達。說明順鉑作用12小時明顯誘導了Caspase-4和Caspase-9的剪切激活，而并沒有激活Caspase-8。
　　d)線粒體膜電位及細胞內(nèi)ATP結(jié)果：30μM的順鉑作用于H0-8910組