Dicer通過(guò)調(diào)控PDIA3影響卵巢癌惡性生物學(xué)行為的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　RNAaseⅢ家族核糖核酸內(nèi)切酶Dicer在上皮性卵巢癌中低表達(dá)并且與疾病的進(jìn)展和生存期短相關(guān)。本研究旨在探究上皮性卵巢癌細(xì)胞中Dicer低表達(dá)所引起的蛋白組學(xué)改變，并尋找Dicer下游關(guān)鍵靶蛋白，以明確 Dicer調(diào)控卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建特異性靶向沉默Dicer基因的短發(fā)卡RNA(shDicer)質(zhì)粒，并連入慢病毒質(zhì)粒載體。shDicer轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞 A2

2、780，CAOV3和 SKOV3，構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Dicer的卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染株。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（WB）檢測(cè)三組細(xì)胞系中Dicer表達(dá)的下調(diào)效率。 EdU增殖實(shí)驗(yàn)，Wound-healing和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)Dicer表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的惡性增殖和遷移能力的變化。
　　3.雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)檢測(cè)上

3、皮性卵巢癌細(xì)胞CAOV3-shNC和CAOV3-shDicer蛋白表達(dá)，并從中挑選出變化最為顯著的蛋白點(diǎn)（表達(dá)差異大于2倍）使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測(cè)，同時(shí)利用qRT-PCR和WB對(duì)這些蛋白點(diǎn)的差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證?；诓町惐磉_(dá)，蛋白功能以及蛋白間相互作用分析，我們篩選出 Dicer下游關(guān)鍵蛋白 PDIA3。Targetscan軟件預(yù)測(cè)，能夠特異性結(jié)合并且調(diào)控PDIA3表達(dá)的microRNAs為miR-148a和miR

4、-494，同時(shí)，qRT-PCR檢測(cè)miR-148a和miR-494在Dicer低表達(dá)的細(xì)胞株中的表達(dá)水平。
　　4.構(gòu)建兩個(gè)靶向沉默PDIA3基因的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染穩(wěn)定下調(diào)Dicer的上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、CAOV3和SKOV3。qRT-PCR和 WB檢測(cè)PDIA3的敲除效率。EdU增殖實(shí)驗(yàn)，Wound-healing和 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)下調(diào) PDIA3對(duì)Dicer沉默后引起卵巢癌細(xì)胞惡性增

5、殖，遷移能力改變的影響。
　　5.建立卵巢癌裸鼠皮下瘤模型，每組5只裸鼠，共五組。分別為SKOV3-shNC，SKOV3-shDicer、SKOV3-shDicer+siPDIA3-1、SKOV3-shDicer+siPDIA3-2和SKOV3-shDicer+5％Glucose。每?jī)商鞙y(cè)量一次皮下瘤的大小并觀察記錄裸鼠一般情況（體重和飲食量）。
　　6.裸鼠處死后，取出皮下瘤，一部分液氮保存，另一部分石蠟包埋。qRT-PC

6、R和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤中 PDIA3、miR-148a和 miR-494的表達(dá)量以及皮下瘤組織切片中增殖標(biāo)志物Ki-67，腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）途徑上皮表型E-cadherin和間質(zhì)表型Vimentin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1. A2780、CAOV3和SKOV3轉(zhuǎn)染shDicer后Dicer的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均下降了60-70

7、%。與對(duì)照組（轉(zhuǎn)染shNC的卵巢癌細(xì)胞）相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shDicer的卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力均明顯增強(qiáng)。
　　2.雙向電泳結(jié)果顯示與CAOV3-shNC相比，CAOV3-shDicer細(xì)胞中的蛋白數(shù)量明顯較多（294±7 VS422±70，p=0.0132）。經(jīng)過(guò)PDQuest軟件分析后，挑選出表達(dá)量改變大于2倍蛋白中表達(dá)差異最明顯的30個(gè)蛋白點(diǎn)做LC-MS/MS鑒定，除去未成功鑒定的和重復(fù)的蛋白點(diǎn)，最后共得到26個(gè)有意義的蛋白

8、。
　　3. String10蛋白相互作用分析數(shù)據(jù)庫(kù)和DAVID蛋白功能分析網(wǎng)站解析了26個(gè)蛋白點(diǎn)與Dicer之間的相互關(guān)系；最終挑選出了7個(gè)與Dicer存在相互作用并且在卵巢癌生物學(xué)進(jìn)展中起著重要作用的靶蛋白。qRT-PCR和WB進(jìn)一步驗(yàn)證了在下調(diào)Dicer的三株卵巢癌細(xì)胞中這7個(gè)靶蛋白的表達(dá)量改變，經(jīng)過(guò)對(duì)蛋白表達(dá)量的變化和蛋白功能的分析，我們得出PDIA3蛋白最有可能成為Dicer下游的關(guān)鍵靶蛋白，并且沉默Dicer表達(dá)后，卵

9、巢癌細(xì)胞A2780，CAOV3和SKOV3中PDIA3的表達(dá)水平升高，而miR-148a和miR-494的表達(dá)顯著降低。
　　4.沉默PDIA3表達(dá)后，下調(diào)Dicer的卵巢癌細(xì)胞A2780，CAOV3和SKOV3的增殖和遷移能力受到明顯抑制。裸鼠在體試驗(yàn)顯示下調(diào)Dicer的卵巢癌細(xì)胞組移植瘤體積明顯大于相應(yīng)對(duì)照組，同時(shí)轉(zhuǎn)染了siPDIA3的低表達(dá)Dicer卵巢癌細(xì)胞組移植瘤的體積明顯小于對(duì)照的低表達(dá)Dicer細(xì)胞組。
　　5

10、. qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示 Dicer低表達(dá)組中 PDIA3表達(dá)水平升高，miR-148a和miR-494的表達(dá)水平降低；同時(shí)增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)信號(hào)增強(qiáng)，EMT途徑相關(guān)上皮表型E-cadherin表達(dá)顯著降低而間質(zhì)表型Vimentin的表達(dá)明顯增多；同時(shí)轉(zhuǎn)染siPDIA3的低表達(dá)Dicer組中，Dicer下調(diào)的卵巢癌細(xì)胞移植瘤中PDIA3表達(dá)量減少，同時(shí)增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)水平也降低，EMT途徑間質(zhì)表型Vi