S100A14和S100A16影響卵巢癌耐藥細(xì)胞生物學(xué)行為的初探.pdf

1、目的:卵巢癌是女性婦科腫瘤中較常見的惡性腫瘤，分化程度低，深度浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因。治療卵巢癌的首選方案是手術(shù)切除腫瘤細(xì)胞后并進(jìn)行藥物化療實(shí)時(shí)監(jiān)測。但是隨著化療的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞會(huì)逐漸的產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果，進(jìn)而大大降低了術(shù)后患者的生存時(shí)間。研究顯示，使卵巢癌發(fā)生耐藥的因素包括:作用在癌旁組織的藥物濃度下降、靶向接觸藥物的位點(diǎn)異常、DNA受損后難以正?；謴?fù)、調(diào)控凋亡途徑的相關(guān)基因突變等均與卵巢癌抗藥相關(guān)。因此，明確卵巢

2、癌的耐藥機(jī)制是改善卵巢癌患者術(shù)后生存率的關(guān)鍵。
　　S100蛋白家族是一類分子量較小的Ca2+結(jié)合蛋白家族，介于9-13kDa之間，在硫酸銨中易溶解，是EF手摸序結(jié)構(gòu)。其家族成員在組織中的表達(dá)具有特異性。S100家族成員較多，不同的成員之間在不同的組織中其功能也不盡相同。S100家族成員中的S100A14，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，能夠編碼104種氨基酸，位置在染色體的1q21.3，由于染色體的頻繁重組和放大，從而導(dǎo)致對S100

3、A14的表達(dá)缺失，S100A14可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲、以及患者的預(yù)后相關(guān)。S100A16的自身特性與其他S100家族成員不同。結(jié)構(gòu)上，在C端S100A16由高度保守的12個(gè)氨基酸構(gòu)成，與S100家族中大部分成員EF端相一致。但在N端位置缺少谷氨酸鹽殘基和由氨基酸組成的loop環(huán)，S100A16的獨(dú)特自身結(jié)構(gòu)對于鈣的調(diào)節(jié)位點(diǎn)非常重要。
　　利用基因芯片篩選，我們發(fā)現(xiàn)S100A14和S100A16在卵巢癌耐藥細(xì)胞中表達(dá)明顯

4、升高，推測可能與腫瘤耐藥相關(guān)。一些S100蛋白添加到細(xì)胞外，能夠引起相應(yīng)的內(nèi)源性蛋白易位。最近，S100蛋白成為主要的與一些疾病相關(guān)的因素，如炎癥、神經(jīng)退行性病變及癌癥等。S100A14和S100A16是S100家族中的兩個(gè)成員，在多種腫瘤細(xì)胞中都呈現(xiàn)表達(dá)異常。S100A14基因在直腸癌和腎癌中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，而在膀胱癌、乳腺癌和子宮的惡性腫瘤中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。研究顯示，在多種卵巢癌細(xì)胞系中S100A14呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示S100A1

5、4在治療卵巢癌耐藥方面可能是潛在標(biāo)志分子。S100A16在乳腺癌、卵巢癌和肺癌中也呈高表達(dá)狀態(tài)。為了證明S100A14和S100A16與卵巢癌的耐藥特性以及其他生物學(xué)行為是否相關(guān)，我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究。
　　S100A14和S100A16在卵巢癌敏感細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但是在卵巢癌耐藥細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)。下調(diào)卵巢癌耐藥細(xì)胞的S100A14和S100A16的表達(dá)后，可以部分恢復(fù)耐藥細(xì)胞的藥物敏感性，同時(shí)也影響著卵巢癌耐藥細(xì)胞的增

6、殖、遷移、凋亡和周期。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示S100A14和S100A16影響了卵巢癌耐藥細(xì)胞的耐藥性可能是通過Bax、Bcl-2、Bcl-xl、P-gp和GST-π途徑共同調(diào)控的。本研究的結(jié)果和結(jié)論表明，通過體外實(shí)驗(yàn)研究探討了卵巢癌耐藥細(xì)胞的耐藥機(jī)制，為臨床上治療卵巢癌耐藥提供理論依據(jù)。
　　研究方法:1、培養(yǎng)不同的卵巢癌敏感細(xì)胞(A2780)和卵巢癌耐藥細(xì)胞(A2780/Tax)。2、利用siRNA轉(zhuǎn)染A2780/Tax，制備S

7、100A14和S100A16低表達(dá)的細(xì)胞系、陰性對照的A2780/Tax細(xì)胞系以及對照組A2780/Tax細(xì)胞系。3、應(yīng)用MTT法檢測A2780和A2780/Tax細(xì)胞系耐藥特性。4、應(yīng)用平板克隆、MTT檢測A2780/Tax細(xì)胞系的增殖特性。5、應(yīng)用Transwell檢測A2780/Tax細(xì)胞系的細(xì)胞遷移。6、應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀檢測A2780/Tax細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。7、應(yīng)用基因芯片篩選技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR檢測A2780和A

8、2780/Tax細(xì)胞系的基因表達(dá)水平。8、應(yīng)用Western blot檢測A2780和A2780/Tax細(xì)胞系的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1、利用RT-PCR、Western blot驗(yàn)證S100A14和S100A16在卵巢癌敏感細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在卵巢癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá)。2、利用RT-PCR、Western blot證實(shí)轉(zhuǎn)染si-RNA后S100A14和S100A16在A2780/Tax的表達(dá)降低。3、敲低S100A14和S1

9、00A16后使A2780/Tax對紫杉醇的耐藥性降低。4、敲低S100A14和S100A16表達(dá)抑制A2780/Tax的增殖和遷移。5、敲低S100A14和S100A16表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。6、敲低S100A14和S100A16表達(dá)，紫杉醇處理后G2/M期阻滯作用增強(qiáng)。
　　結(jié)論:在卵巢癌耐藥細(xì)胞中，S100A14和S100A16均呈高表達(dá)狀態(tài)，而在卵巢癌敏感細(xì)胞中卻幾乎不表達(dá)。下調(diào)S100A14和S100A16及兩者聯(lián)合下調(diào)后可以