神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，嚴(yán)重危害女性的生命健康。卵巢癌是高度異質(zhì)性腫瘤，組織學(xué)亞型較多，不同類型的卵巢癌在形態(tài)特征、臨床表現(xiàn)、遺傳改變、腫瘤行為等方面均表現(xiàn)出一定的差異，且難以在早期發(fā)現(xiàn)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移、化療耐藥、復(fù)發(fā)，使卵巢癌的診斷和治療都面臨著極大的挑戰(zhàn)。卵巢癌的致病機(jī)理十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。一般的觀點(diǎn)認(rèn)為卵巢癌的發(fā)生既與卵巢特殊的解剖結(jié)構(gòu)、機(jī)械刺激等有關(guān)，也與卵巢微環(huán)境中生長(zhǎng)因子、黏附

2、因子、免疫炎性反應(yīng)因子等的功能失調(diào)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子發(fā)生異位、突變、丟失、結(jié)構(gòu)重排等使細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡失控而引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相連。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是一種多效性的肽類激素，通過與靶細(xì)胞表面的高親和力受體TrkA和低親和力受體P75結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理活動(dòng)，對(duì)機(jī)體正常生理狀態(tài)和病理發(fā)展有重要的影響。近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)：NGF及受體（NGFRs）在乳腺癌、前列腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤等惡性腫瘤中廣泛

3、表達(dá)，異常表達(dá)的NGF/NGFRs影響腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等過程。NGF/NGFRs在正常卵巢組織中低表達(dá)，能調(diào)節(jié)垂體分泌卵泡刺激素（FSH）及卵巢上皮表面FSH受體水平、卵泡發(fā)育、排卵等卵巢正常生理功能，異常表達(dá)的NGF/NGFRs會(huì)引起卵泡刺激素分泌紊亂，導(dǎo)致上皮性卵巢癌的啟動(dòng)和發(fā)生。但NGF/NGFRs參與卵巢癌的啟動(dòng)、發(fā)生、發(fā)展及作用機(jī)理等方面的知識(shí)了解甚少，作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入了解NGF/

4、NGFRs對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)卵巢癌的預(yù)防、診斷、治療、預(yù)后等有重要意義。本文的主要研究?jī)?nèi)容包括：
　?、倏疾霳GF/NGFRs在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)。采用定量RT-PCR和Western blot法檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)（含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基）條件下NGF/NGFRs在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3、OVCAR3、CAOV3中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：NGF/NGFRs均同時(shí)在這幾種卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)，內(nèi)源

5、性的NGF在OVCAR3、CAOV3細(xì)胞中表達(dá)水平較高，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　?、诳疾霳GF/NGFRs對(duì)卵巢癌細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)節(jié)律、凋亡的影響。采用細(xì)胞行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)、定量RT-PCR、Western blot等方法檢測(cè)NGF/NGFRs對(duì)卵巢癌細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)節(jié)律、凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響。通過特異性的NGF/NGFRs抑制劑阻斷NGF/NGFRs的作用，考察NGF/NGF

6、Rs在卵巢癌細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)節(jié)律、凋亡中的作用。結(jié)果顯示：NGF下調(diào)CAOV3和OVCAR3細(xì)胞中SIRT1（Sirtuin1）、Survivin的表達(dá)水平，減弱卵巢癌細(xì)胞的存活能力；NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細(xì)胞中Ki67、PPARδ，下調(diào)PCNA的表達(dá)水平，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力；NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細(xì)胞中Cyclin E1、P21，下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)水平，影響卵巢癌的周期調(diào)控，

7、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡；NGF下調(diào)CAOV3和OVCAR3細(xì)胞中Clock、FBXL3的表達(dá)水平，影響卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)節(jié)律，但具體的生物學(xué)效應(yīng)還需要進(jìn)一步深入研究；NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細(xì)胞中P53、BCL2、Caspase9，下調(diào)Caspase3、Caspase7的表達(dá)水平，上調(diào)CAOV3細(xì)胞中CYCS的表達(dá)而下調(diào)OVCAR3細(xì)胞中的CYCS，下調(diào)CAOV3細(xì)胞中BAX的表達(dá)而上調(diào)OVCAR3細(xì)胞中的BAX，影響卵巢癌細(xì)胞的

8、凋亡過程。
　?、劭疾霳GF/NGFRs對(duì)卵巢癌細(xì)胞粘附能力的影響。采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、定量RT-PCR、Western blot等方法檢測(cè)NGF/NGFRs對(duì)卵巢癌細(xì)胞粘附能力、緊密連接相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細(xì)胞中緊密連接蛋白CLDN3、CLDN4的表達(dá)水平，下調(diào)CAOV3細(xì)胞中緊密連接蛋白CLDN1的表達(dá)而上調(diào)OVCAR3細(xì)胞中的表達(dá)水平，影響卵巢癌細(xì)胞間的連接狀態(tài)， NG

9、F/NGFRs的抑制劑能阻斷這種作用。結(jié)果表明：NGF/NGFRs能通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞間的緊密連接狀態(tài)而參與卵巢癌細(xì)胞成團(tuán)、運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)。
　?、芸疾霳GF/NGFRs對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的影響及分子機(jī)制。利用Transwell小室及本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的微流控芯片考察NGF對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移行為的影響；通過定量RT-PCR、Western blot法檢測(cè)NGF對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子β-catenin及下游靶

10、基因CD44、C-myc、MMP2、MMP7、TIMP2等表達(dá)的影響，考察NGF影響卵巢癌細(xì)胞遷移能力變化的分子機(jī)制。結(jié)果顯示：不管是在二維培養(yǎng)還是三維培養(yǎng)條件下，NGF均能影響CAOV3和OVCAR3的遷移能力；NGF對(duì)經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)中的關(guān)鍵分子及下游靶基因的表達(dá)有影響，NGF可通過激活或調(diào)控WNT/β-catenin信號(hào)通路影響卵巢癌細(xì)胞的遷移。NGF對(duì)不同卵巢癌細(xì)胞遷移變化的影響有一定的差異性，說明NGF對(duì)卵巢

11、癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)有細(xì)胞特異性。
　　綜上所述，得出以下結(jié)論：NGF/NGFRs在選擇的這幾種上皮性卵巢癌細(xì)胞系中均表達(dá)；NGF能調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，影響卵巢細(xì)胞的周期和生長(zhǎng)節(jié)律；NGF能調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中緊密連接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4的表達(dá)，影響卵巢癌細(xì)胞之間的連接狀態(tài)，參與卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程；NGF可通過經(jīng)典的WNT/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的遷移行為。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)