miRNA-544a對(duì)上皮性卵巢癌生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌是婦科腫瘤中致死率最高的腫瘤。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)、免疫炎癥細(xì)胞和腫瘤血管的共同作用有關(guān)，腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與侵襲不但與腫瘤細(xì)胞的遺傳突變有關(guān)，而且與腫瘤間質(zhì)微環(huán)境有關(guān)。炎癥與腫瘤的關(guān)系主要研究一下兩方面:炎癥性細(xì)胞因子白介素-17的功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;Nod樣受體（病原和細(xì)胞應(yīng)激識(shí)別受體）的功能及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活機(jī)制[4]。在上皮性卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞:

2、Regulatory cells）可以通過(guò)IL-2轉(zhuǎn)化為CD4+IL-17+細(xì)胞，從而減輕Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為18-25nt的非蛋白編碼小RNA，它通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3'UT R而抑制基因的表達(dá)，表現(xiàn)為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的全新機(jī)制，在細(xì)胞發(fā)育、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理與病理過(guò)程中均發(fā)揮重要調(diào)控作用。miRNA通過(guò)調(diào)控靶基因來(lái)發(fā)揮作用。
　

3、　miRNA在多種生物過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化、增值、凋亡及血管形成。同一miRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因，同一個(gè)基因又可以受到多個(gè)不同miRNA的調(diào)節(jié)。多種miRNA影響卵巢癌的侵襲遷移能力。上皮間質(zhì)化EMT為促進(jìn)上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要途徑[12-15]，表現(xiàn)為上皮性標(biāo)志物E-cadherin下調(diào)，間質(zhì)化標(biāo)志物N-cadherin、ZEB1、ZEB2、Vimentin上調(diào)。miR-200/ZEB1雙向調(diào)控是EMT主要調(diào)節(jié)者之一

4、[16]，多項(xiàng)研究表明，卵巢癌中miRNA-200家族調(diào)控靶基因ZEB1和ZEB2。miR-506也是一種關(guān)鍵的EMT抑制基因，通過(guò)直接作用于靶基因SLUG(SNAI2)、vimentin和N-cadherin這些間質(zhì)表型的關(guān)鍵分子發(fā)揮抑癌作用[17]。過(guò)表達(dá)miRNA-544a在胃癌中通過(guò)E-cadheri的減少，Vimentin上調(diào)促進(jìn)EMT促進(jìn)胃癌發(fā)展，作為WNT信號(hào)通路的主要成分的AXIN2和APC2為miR-544a的直接間接

5、靶基因，miR-544a誘導(dǎo)EMT[18]。在另一項(xiàng)研究中，上皮性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染EMT促進(jìn)因子HMGA2降低了miR-15a，miR-18a，miR-22和miR-29b的水平而Let-7家庭成員表達(dá)高升高。靶基因與miRNA之間可以互相調(diào)控，實(shí)現(xiàn)在上皮和間質(zhì)之間轉(zhuǎn)化。最近，microRNA被證明參與了正常的成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y相關(guān)纖維細(xì)胞，通過(guò)對(duì)miRNA-31和miRNA-214和miR-155的下調(diào)，而趨化性因子CCL5被確定為

6、miR-214的靶基因，這表明在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控中起到重要作用。其他重要的細(xì)胞過(guò)程如:缺氧和血管生成在卵巢癌中受miRNAs調(diào)控。miRNA-199A的3-UTR端相關(guān)靶基因HIF-1α和HIF-2α，在缺氧環(huán)境下，miRNA-199a的表達(dá)降低，導(dǎo)致了HIF的升高。miR-200的成員能夠通過(guò)抑制靶基因CXCL1和IL-8來(lái)抑制血管生成，降低惡性腫瘤形成。這給予我們提示，卵巢癌致病因素及過(guò)程并不是單一途徑，利用卵巢癌的致癌基因與miR

7、NA之間關(guān)系及miRNA致癌基因與腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子、炎癥因子關(guān)系來(lái)調(diào)控降低卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移。
　　第一部分 炎性細(xì)胞因子在上皮性卵巢癌的表達(dá)及其相關(guān)性
　　研究目的:
　　通過(guò)檢測(cè)IL-17在上皮性卵巢腫瘤的表達(dá)，研究其與臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，研究其與EMT的關(guān)系，探索其與卵巢癌診治及預(yù)后的關(guān)系。
　　研究方法:
　　收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦科自2013年1月至2015年12月收住院的卵巢惡性上皮性腫瘤術(shù)后組

8、織標(biāo)本50例。均經(jīng)病理診斷證實(shí)為惡性上皮性腫瘤，10例良性卵巢上皮性腫瘤組織及10例正常卵巢上皮組織作為對(duì)照。免疫組化檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子IL-17A、IL-17D、上皮性標(biāo)志物E-cadherin及間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin在卵巢惡性上皮性腫瘤組織、卵巢良性上皮性腫瘤組織及正常卵巢上皮組織中的表達(dá)情況。分析細(xì)胞因子及上皮-間質(zhì)標(biāo)志物與臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果:
　　1.IL-17A的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，切片染色后IL-1

9、7A呈棕黃色位于細(xì)胞漿IL-17D位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，表現(xiàn)為淺黃色染色。IL-17A和IL-17D在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而卵巢良性上皮性腫瘤及正常卵巢上皮組織不表達(dá)。
　　2.通過(guò)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50例惡性卵巢上皮性腫瘤被分為IL-17A陽(yáng)性組及IL-17D陽(yáng)性組。IL-17A及IL-17D在臨床分期晚期及腫瘤分化程度呈低分化組織中高表達(dá)，在病理類型上IL-17A及IL-17D表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有明顯差異。無(wú)腹水及腹

10、水量少于500ml及腹水超過(guò)500ml，IL-17A和IL-17D在二者表達(dá)率統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異。IL-17A和IL-17D表達(dá)陽(yáng)性率高組Vimentin表達(dá)陽(yáng)性率也高，而E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率低。
　　研究結(jié)論:
　　1.與正常卵巢組織及良性上皮性卵巢腫瘤組織相比較，上皮性卵巢癌組織中IL-17A、IL-17D及Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率高。而E-cadherin在上皮性卵巢癌中低表達(dá)，在卵巢良性腫瘤及正常卵巢組織

11、中陽(yáng)性表達(dá)率高。
　　2.高臨床期別、低分化上皮性卵巢癌IL-17A、IL-17D及Vimentin高表達(dá)。而E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率低。腹水的量及上皮性卵巢癌組織類型的表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差別。
　　3.這一結(jié)果推測(cè)炎癥細(xì)胞因子及間質(zhì)化標(biāo)志物共同促進(jìn)卵巢癌侵襲性轉(zhuǎn)移性。
　　第二部分 miRNA-544a在卵巢癌中的表達(dá)及對(duì)卵巢癌的生物學(xué)行為研究
　　研究目的:
　　通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miRNA-5

12、44a在正常卵巢上皮組織及上皮性卵巢癌組織中的mRNA表達(dá)，正常卵巢上皮細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、HO8910、SKOV3中miRNA-544a的表達(dá)，研究其與臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，探索其與卵巢癌轉(zhuǎn)移侵襲性的關(guān)系。通過(guò)在卵巢癌細(xì)胞株中分別過(guò)表達(dá)miRNA-544a mimics，檢測(cè)miRNA-544a對(duì)卵巢上癌細(xì)胞的遷移侵襲性影響，并通過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)后細(xì)胞中的E-cadherin(CDH1)和Vim

13、entin的mRNA及蛋白表達(dá)水平，以判斷miRNA-544a促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。
　　研究方法:
　　收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦科自2015年11月至2016年11月收住院的卵巢惡性上皮性腫瘤術(shù)后組織標(biāo)本36例，均經(jīng)病理檢查診斷為惡性上皮性腫瘤。13例正常卵巢上皮組織。RT-PCR檢測(cè)miRNA-544a在正常卵巢上皮組織及上皮性卵巢癌組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量，上皮性標(biāo)志物E-cadherin及間質(zhì)性標(biāo)志物Viment

14、in的mRNA水平在卵巢惡性上皮性腫瘤、正常卵巢上皮組織中的表達(dá)情況。采用免疫印跡法，檢測(cè)隨機(jī)抽取3例卵巢癌組織及正常卵巢組織E-cadherin及Vimentin的蛋白表達(dá)情況。Transewell小室遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miRNA-544a對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲性的影響。RT-PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)染miRNA-544amimics后上皮性卵巢癌細(xì)胞中的CDH1和Vimentin的mRNA水平相對(duì)表達(dá)量，免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中E-c

15、adherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.miRNA-544a mRNA水平在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中顯著升高，而正常卵巢上皮組織中低表達(dá)。
　　2.miRNA-544a mRNA水平在正常人卵巢上皮細(xì)胞HOSepiC中低表達(dá)，上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、HO8910、SKOV3中高表達(dá)。
　　3.在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中:檢測(cè)隨機(jī)抽取3例卵巢癌組織及正常卵巢組織，檢測(cè)癌組織中E-cadh

16、erin的蛋白水平表達(dá)低于正常卵巢組織中的蛋白水平，而Vimentin在癌組織中蛋白水平高于正常卵巢組織的蛋白水平。
　　4.Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA-544a過(guò)表達(dá)有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲性的能力。
　　5.RT-PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)染miRNA-544amimics后上皮性卵巢癌細(xì)胞中的CDH1mRNA水平下調(diào)而Vimentin的mRNA水平上調(diào)。
　　6.在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)miRNA-544a后檢測(cè)

17、癌細(xì)胞中E-cadherin的蛋白水平表達(dá)降低，而Vimentin蛋白表達(dá)水平升高。
　　研究結(jié)論:
　　1.與正常卵巢組織相比較，上皮性卵巢癌中miRNA-544a mRNA及Vimentin mRNA水平高表達(dá)。而E-cadherin的mRNA及蛋白水平在上皮性卵巢癌中低表達(dá)。正常卵巢上皮細(xì)胞及正常卵巢組織中miRNA-544a低表達(dá)，E-cadherin的mRNA水平及蛋白水平高表達(dá)，Vimentin的mRNA及蛋白水