肌酸激酶對(duì)上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移及NF-κB信號(hào)通路活性影響的研究.pdf

1、肌酸激酶是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)參與能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生的重要激酶。腦型肌酸激酶（Creatine Kinase Brain-type，CKB）在乳腺癌、卵巢癌、大腸癌及結(jié)腸癌等多種癌癥中的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，前期研究發(fā)現(xiàn)敲低CKB可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)。NF-κB信號(hào)通路可以參與一系列與炎癥發(fā)生、免疫應(yīng)答相關(guān)基因的調(diào)控，該通路中的核心蛋白NF-κB主要以p65/p50二聚體的形式存在，作為轉(zhuǎn)錄因子在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作

2、用。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CKB很有可能參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控。本課題擬在此前的研究基礎(chǔ)上，探究CKB對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移的影響，揭示CKB對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路NF-κB的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）CKB調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的活性。以卵巢癌SKOV3細(xì)胞株為材料，通過(guò)RNA干涉技術(shù)轉(zhuǎn)染siRNA敲低CKB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生了顯著的下調(diào)，這些基因大多數(shù)是NF-κB信號(hào)通路的下游基因，特別是NF-κB信號(hào)

3、通路核心蛋白p65的水平也發(fā)生下調(diào)，而通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)CKB后，則p65蛋白的水平呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。SKOV3細(xì)胞中具有活性的磷酸化的p65和IκB的變化與CKB的變化一致，這表明改變CKB蛋白的表達(dá)會(huì)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的活性。
　?。?）CKB通過(guò)影響p65蛋白泛素化水平調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的活性。qRT-PCR結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)CKB蛋白的表達(dá)對(duì)p65蛋白的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有明顯影響；而下調(diào) CKB蛋白的表達(dá)同時(shí)

4、抑制新生蛋白質(zhì)的合成，p65蛋白的半衰期縮短，上調(diào)CKB蛋白的表達(dá)則反之。Western blot結(jié)果證明，下調(diào)CKB蛋白表達(dá)增加了p65蛋白的泛素化的修飾程度，這說(shuō)明敲低 CKB可改變 p65蛋白泛素化修飾加快其降解，從而降低NF-κB信號(hào)通路的活性。
　　（3）CKB與p65蛋白的RHD結(jié)構(gòu)域相互作用影響p65泛素化。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，CKB蛋白和p65蛋白在SKOV3細(xì)胞中互作；利用帶His標(biāo)簽的p65蛋白進(jìn)行鎳柱親和結(jié)合

5、實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明CKB能夠與p65蛋白專(zhuān)一結(jié)合。進(jìn)一步將p65的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RHD和CTD分別構(gòu)建在質(zhì)粒上轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，免疫共沉淀結(jié)果表明，只有RHD結(jié)構(gòu)域可以與CKB結(jié)合，此結(jié)構(gòu)域也是E3泛素連接酶（ING4或PPARγ）與p65的結(jié)合部位，在SKOV3細(xì)胞中上調(diào)CKB蛋白的表達(dá)，阻礙了這兩種E3泛素連接酶與p65的結(jié)合，這些結(jié)果表明p65的RHD結(jié)構(gòu)域與CKB的結(jié)合，在調(diào)控p65蛋白的泛素化降解過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
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6、4）調(diào)控 CKB蛋白的表達(dá)影響卵巢癌細(xì)胞體外遷移和侵襲。為了探究 CKB蛋白的表達(dá)是否對(duì) SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲有影響，我們利用慢病毒感染的方法構(gòu)建了穩(wěn)定敲低CKB蛋白表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞（CKB-/--SKOV3），傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)都表明，該細(xì)胞株在下調(diào) CKB蛋白表達(dá)后，細(xì)胞的遷移率發(fā)生了顯著降低。Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低CKB蛋白的表達(dá)也抑制了細(xì)胞的侵襲能力。
　?。?）調(diào)控CKB蛋白

7、的表達(dá)影響卵巢癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤和轉(zhuǎn)移。以慢病毒感染穩(wěn)定敲低 CKB蛋白的卵巢癌細(xì)胞（CKB-/--SKOV3）為材料，分別用皮下注射、腹腔注射的方法構(gòu)建異種移植瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤裸鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常表達(dá)CKB的SKOV3細(xì)胞相比，下調(diào)CKB蛋白表達(dá)的SKOV3細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤的能力降低，腫瘤的體積和重量減少，腹腔內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目也明顯降低。
　　研究結(jié)果揭示了CKB對(duì)NF-κB這一經(jīng)典信號(hào)途徑的影響，對(duì)深入理解肌酸