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文檔簡介
1、目的:
1.病原菌的入侵通常引起宿主 NF-κB信號通路的活化,鼠疫菌蛋白 SycE、YscL、YscS是T3SS的組成成分,YscL是為T3SS轉運效應蛋白提供能量的YscN ATTPase的調控蛋白;YscS是分泌裝置的成分蛋白。通過檢測鼠疫菌蛋白 SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL對宿主NF-κB信號通路的影響,對初步研究鼠疫菌可能的致病機制提供依據。
2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)
2、效應蛋白,VASP是人的一種細胞骨架調節(jié)蛋白,通過體外驗證YpkA對VASP的磷酸化作用,對鼠疫菌的致病可能的機制進行初步的探討。
方法:
1. LB液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌,試劑盒提取其基因組DNA。設計引物,PCR擴增yscL基因,插入pCMV-Myc質粒,構建重組質粒pCMV-Myc-yscL,經測序分析正確后大量提取質粒,去內毒素后用于轉染293T細胞。
2.大量提取本實驗室已構建好的表達S
3、ycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去內毒素提取質粒,轉染293T細胞。
3.利用瞬時轉染技術,將以上提取的質粒分別轉入293T細胞,以anti-Myc抗體為一抗,WB方法檢測以上5種蛋白在293T細胞中的表達。表達正確后,再分別與表達螢火蟲熒光素酶的pBII-LUC質粒和表達海腎熒光素酶的pRL-TK質粒共轉染293T細胞。然后用TNF-α刺激293T細胞,在化學發(fā)光板上檢測熒光素酶的
4、活性。
4.在大腸桿菌BL21中表達YpkA蛋白,用Glutathione Sepharose4B?珠子純化YpkA;在293T細胞中表達VASP,Flag珠子純化VASP。將純化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶緩沖液混合,30℃反應30min,設立陽性和陰性對照組,分別用WB和同位素標記法檢測VASP的磷酸化。
5.統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析實驗結果,統(tǒng)計方法為方差分析。
結果:
1.序
5、列分析結果顯示pCMV-Myc-yscL構建正確。
2. WB結果顯示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T細胞中得到正確表達。
3.雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示:SycE、YPO3877、YscS和YscL實驗組的熒光素酶活性比陰性對照組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);YPO2940組熒光素酶活性比陰性對照組沒有降低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
4. WB
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