基于cDNA文庫(kù)方法的鼠疫耶爾森氏菌sRNAs的篩選與鑒定研究.pdf

1、背景：
　　 細(xì)菌中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的非編碼RNA,稱為“調(diào)節(jié)小RNA”(sRNA)。調(diào)節(jié)sRNA參與到病原體侵染宿主的應(yīng)激過(guò)程。鼠疫的病原菌--鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)是以蚤類為傳播媒介,在嚙齒動(dòng)物間傳播的,感染機(jī)體后,鼠疫菌能在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活繁殖。面對(duì)多宿主復(fù)雜的環(huán)境因素,鼠疫菌必須能夠感應(yīng)并快速適應(yīng)每個(gè)環(huán)節(jié)的環(huán)境變化,才能最終在宿主體內(nèi)存活和在自然界中傳播并最終致病,而每個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)也必然伴隨著嚴(yán)格的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。依據(jù)

2、鼠疫菌在宿主體內(nèi)可能遇到的脅迫環(huán)境,我們采用五個(gè)不同體外模擬條件培養(yǎng)鼠疫菌,通過(guò)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的方法來(lái)發(fā)現(xiàn)鼠疫菌在多種體外條件下表達(dá)的sRNA,試圖從整個(gè)基因組水平上獲得新的、鼠疫菌特異的sRNA,為其功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 本研究旨在鑒定鼠疫菌傳播感染過(guò)程中參與基因調(diào)控的sRNA分子,因此,我們依據(jù)鼠疫菌在傳播和感染過(guò)程中可能面臨的環(huán)境,設(shè)計(jì)并實(shí)施了多個(gè)體外模擬刺激的條件,包括溫度、生長(zhǎng)時(shí)期、鐵缺乏(

3、模擬宿主體內(nèi)低鐵環(huán)境)、低鈣(模擬感染初期Ⅲ型分泌系統(tǒng)的形成環(huán)境)和低鎂(模擬巨噬細(xì)胞中溶酶體環(huán)境)5種刺激因素,對(duì)5種條件的鼠疫菌總RNA進(jìn)行提取,等比例混合后利用膠回收和氯化鈉濃度梯度洗脫方法獲得50～400nt長(zhǎng)度范圍的RNA,在RNA分子的5'和3'端加上特異接頭,逆轉(zhuǎn)錄后構(gòu)建cDNA文庫(kù)。對(duì)獲得的cDNA克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序,對(duì)獲得的序列進(jìn)行基因定位,將基因間區(qū)或反義鏈上的序列作為候選sRNA。依據(jù)序列與基因的相對(duì)位置,對(duì)

4、候選小RNA進(jìn)行分類,每一類中挑選出有代表性的若干sRNA進(jìn)行Northern Bbt和RACE的實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其真實(shí)存在性和完整性,并對(duì)文庫(kù)中得到的70nt以上的sRNA進(jìn)行Real-time PCR的定量分析。最后,通過(guò)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)軟件Mfold對(duì)獲得的對(duì)sRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 通過(guò)上述RNA組學(xué)的方法和每一步實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控,我們發(fā)現(xiàn)了43個(gè)非編碼RNA,其中6個(gè)已經(jīng)注釋的RNA

5、s,其中25個(gè)為注釋基因反義鏈編碼的的sRNAs。有趣的是,其中2個(gè)與非編碼RNA完全互補(bǔ)。另外我們還發(fā)現(xiàn)了8個(gè)新基因間區(qū)的sRNAs。Northern blot成功的驗(yàn)證了10個(gè)候選的sRNAs。29個(gè)候選sRNAs的表達(dá)分析顯示24個(gè)sRNAs在鼠疫菌進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)高表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究將能獲得全長(zhǎng)RNA序列的RACE技術(shù)結(jié)合到cDNA文庫(kù)的構(gòu)建工作中,因此我們的方法更易于獲得真實(shí)的、全長(zhǎng)的sRNA分子。