cAMP受體蛋白調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌毒力的研究.pdf

1、鼠疫的病原菌是鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)鼠疫菌)，在自然界，鼠疫的主要宿主是嚙齒動(dòng)物，主要通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物蚤的叮咬在宿主之間傳播。通過(guò)蚤叮咬或者其它途徑，鼠疫可以傳染給人，引發(fā)腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。 鼠疫菌從鼠蚤傳播到新的宿主過(guò)程中，經(jīng)歷了溫度，滲透壓，離子濃度，PH，氧等信號(hào)的改變，鼠疫菌必須適應(yīng)相應(yīng)的環(huán)境壓力才能存活并維持其毒力和致病性，而每個(gè)適應(yīng)性反應(yīng)也必然伴隨著鼠疫菌基因轉(zhuǎn)錄的改變，這體現(xiàn)在：很多特定的調(diào)控子，分別感應(yīng)特

2、定的外界信號(hào)，介導(dǎo)特定基因(包括毒力基因)表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)，最終組成復(fù)雜的毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制鼠疫菌在媒介和貯存宿主中生存能力和致病力。 cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)作為細(xì)菌調(diào)控子能調(diào)控E.coli的100多個(gè)基因，包括參與分解代謝抑制的基因。在本實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了鼠疫菌201株的crp突變株(△crp)和回復(fù)株。通過(guò)體內(nèi)外的毒力表型實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CRP的毒力調(diào)控表型。利用比較芯片表達(dá)譜分析生長(zhǎng)在

3、TMH—1mMcAMP中的鼠疫菌201株和△crp的差異表達(dá)基因，根據(jù)E.coli CRP的基序的特點(diǎn)，用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)可能受CRP直接調(diào)控的靶基因38個(gè)，進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和EMSA(凝膠阻滯實(shí)驗(yàn))來(lái)驗(yàn)證確定CRP的最小調(diào)控元。在此基礎(chǔ)上，選取水平轉(zhuǎn)移獲得的毒力相關(guān)的質(zhì)?；騪la，pst和操縱子sycO—ypkA—yopJ進(jìn)行精細(xì)調(diào)控機(jī)制的研究。通過(guò)體內(nèi)的LacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)證明CRP對(duì)pla，pst和ypkA有

4、直接調(diào)控作用，然后分別用引物延伸實(shí)驗(yàn)(Primer extension assay)和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)(DNaseⅠfootprinting assay)確定上述毒力基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，核心啟動(dòng)子元件和CRP結(jié)合位點(diǎn)序列，揭示上述基因的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)構(gòu)圖。 表型實(shí)驗(yàn)顯示crp的突變?cè)隗w內(nèi)和體外均影響突變株的生長(zhǎng)，體外的生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示△crp的倍增時(shí)間長(zhǎng)于WT，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明皮下途徑感染時(shí)突變株的毒力比相應(yīng)的野生株下降了15

5、，000多倍，而靜脈途徑感染時(shí)，突變株的毒力大約下降了40倍。因此CRP是鼠疫菌毒力所必須的，并且在皮下感染途徑中更重要。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)crp突變株的生長(zhǎng)減慢可能是導(dǎo)致兩種感染途徑中突變株毒力減弱的部分原因。而相應(yīng)的回復(fù)株能恢復(fù)crp缺失株的毒力表型，達(dá)到與野生株的毒力表型一致的水平。先前的實(shí)驗(yàn)證明由Pla編碼的纖維蛋白酶原激活劑能特異性的促進(jìn)鼠疫菌從外周感染部位(皮下感染[跳蚤叮咬]或者吸入)擴(kuò)散。以上的實(shí)驗(yàn)證據(jù)都說(shuō)明crp突變株中pl

6、a的表達(dá)缺失除了能降低體內(nèi)的生長(zhǎng)表型外，還能大大降低該突變株在皮下感染途徑中的毒力。 在本實(shí)驗(yàn)中，用鼠疫全基因組芯片采用雙色熒光的比較芯片表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)分析生長(zhǎng)在TMH—1mMcAMP中的鼠疫菌田鼠型的野生株和△crp，篩選出278個(gè)差異表達(dá)基因，其中△crp相比于野生株(WT)，有104個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，174個(gè)下調(diào)。 匯總E.coli CRP結(jié)合位點(diǎn)，用consensus—matrix和convert—matrix程序計(jì)算

7、CRP結(jié)合序列每個(gè)位置四個(gè)堿基出現(xiàn)的權(quán)重，得到CRP結(jié)合序列的Matrix，進(jìn)而用WebLogo軟件展示序列l(wèi)ogo，最終預(yù)測(cè)得到CRP結(jié)合box：TGTGA—N6-TCTCA。利用Matrix scan程序查找278個(gè)差異表達(dá)基因中的保守CRP基序，找到38個(gè)與基序匹配分值高(以8為界值)的基因作為候選可能受CRP直接調(diào)控的靶基因。后續(xù)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)顯示有36個(gè)基因或者假定的操縱子受CRP直接調(diào)控，構(gòu)

8、成了鼠疫菌CRP的最小調(diào)控元，其中YPO2468的芯片表達(dá)譜結(jié)果與實(shí)時(shí)定量RT-PCR不一致，而yopD雖然芯片表達(dá)譜，實(shí)時(shí)定量RT-PCR，EMSA以及足跡實(shí)驗(yàn)都證實(shí)可能為CRP調(diào)控元，但引物延伸和lacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)CRP對(duì)yopD有直接調(diào)控作用，因此這兩個(gè)基因不是CRP調(diào)控元。pla，pst和ypkA的lacZ融合實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRP能正調(diào)控水平獲得的質(zhì)?；騪la，pst，而負(fù)調(diào)控ypkA。通過(guò)引物延伸實(shí)驗(yàn)(Primer

9、extension assay)和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)(DNaseⅠfootprinting assay)定位了pla，pst和sycO—ypkA—yopJ操縱子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，核心啟動(dòng)子元件(—10和—35區(qū))和CRP結(jié)合位點(diǎn)，三者一起揭示了CRP與pla，pst，sycO—ypkA—yopj啟動(dòng)子DNA相互作用的結(jié)構(gòu)圖。 pla，pst的CRP位點(diǎn)均位于啟動(dòng)子區(qū)—35區(qū)的上游，cAMP—CRP與啟動(dòng)子DNA結(jié)合后，促進(jìn)RNA

10、聚合酶的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為激活轉(zhuǎn)錄作用。 鼠疫菌中的sycO，ypkA和yopJ基因組成一個(gè)三聯(lián)體的操縱子，sycO—ypkA—yopJ操縱子上僅有一個(gè)受CRP調(diào)控的啟動(dòng)子，但是啟動(dòng)子上有2個(gè)CRP結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)1和位點(diǎn)2)，并且只在位點(diǎn)1上找到CRP box的同源序列，說(shuō)明位點(diǎn)1是真正的CRP位點(diǎn)，而位點(diǎn)2應(yīng)該是無(wú)效位點(diǎn)。而sycO的CRP位點(diǎn)則位于—10區(qū)的下游，阻礙了RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄延伸，因此表現(xiàn)為抑制調(diào)控作用。 無(wú)論

11、是CRP蛋白還是pla，pst和sycO—ypkA—yopJ啟動(dòng)子區(qū)，其在4種鼠疫菌生物型中，即古生型，中世紀(jì)型，東方型和田鼠型，是相當(dāng)保守的。因此，本研究中的田鼠型鼠疫菌的結(jié)果可以普遍運(yùn)用于其它鼠疫生物型中。 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，不僅首次界定了鼠疫菌田鼠型的CRP最小調(diào)控元，推測(cè)出CRP可能的調(diào)控元。結(jié)合相應(yīng)的體內(nèi)外表型實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)并精細(xì)研究了CRP直接調(diào)控毒力基因pla，pst和sycO—ypkA—yopJ操縱子的機(jī)制。CRP