鼠疫耶爾森氏菌LcrV突變體的初步研究.pdf

1、鼠疫[9]是一種自然疫源性的烈性傳染病,其病原體為鼠疫耶爾森菌[8],歷史上6世紀(jì)、14-15世紀(jì)、19世紀(jì)發(fā)生的3次世界性鼠疫大流行致使超過(guò)2億人喪生,給人類造成了巨大的災(zāi)難[27]。近年來(lái)隨著國(guó)際反恐斗爭(zhēng)的需要[1],對(duì)鼠疫的防治研究已成為國(guó)際生物醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。
　　低鈣反應(yīng)V抗原(Low-CalciumResponseVantigen,LcrV)是鼠疫耶爾森氏菌重要的毒力因子,同時(shí)也是鼠疫耶爾森氏菌主要的保護(hù)性抗原,

2、它構(gòu)成了Ⅲ型分泌系統(tǒng)注射體的針尖,調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌,直接產(chǎn)生抗炎癥作用,因而在鼠疫菌的感染與免疫中發(fā)揮重要作用[7,51]。V抗原由326個(gè)氨基酸組成的,分子量37kDa,其273位氨基酸為半胱氨酸,可以此產(chǎn)生分子間二硫鍵形成同源二聚體[12,52],然而此半胱氨酸殘基在感染與免疫中的意義尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　接種鼠疫疫苗已被證明是預(yù)防鼠疫的有效手段[47]。目前世界上人用鼠疫疫苗主要有兩類,一類是全細(xì)胞滅活疫苗,其中甲醛滅

3、活的全菌苗(KWCV)曾在美國(guó)獲得FDA批準(zhǔn),然而已于1999年停止生產(chǎn)使用;另一類是減毒活疫苗,主要在我國(guó)和俄羅斯使用[15,16]。這兩種疫苗雖然安全有效,并曾被長(zhǎng)期使用,但都存在一些缺陷,如生產(chǎn)安全性要求高,免疫操作或免疫程序復(fù)雜,質(zhì)控困難等。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外都在加緊發(fā)展新型鼠疫疫苗,研究發(fā)現(xiàn)重組F1[10]和LcrV抗原都能有效地保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抵抗鼠疫菌攻擊,而二者聯(lián)用可產(chǎn)生比單獨(dú)使用更好的效果[20,23,28]。由于F1抗原缺失

4、的鼠疫菌仍然具有毒力,所以LcrV抗原的免疫效果對(duì)新型亞單位鼠疫疫苗至關(guān)重要[39]。美國(guó)和英國(guó)的鼠疫亞單位疫苗都已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[43]。
　　新藥研發(fā)中的需要對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制。V抗原因Cys273的存在導(dǎo)致其出現(xiàn)二聚體形式,雖然根據(jù)研究,單聚體和二聚體都具有免疫保護(hù)性,二聚體的免疫原性甚至更強(qiáng),但實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中增加了質(zhì)量控制的難度。本研究制備了LcrVm蛋白,對(duì)LcrVm與LcrV在理化性質(zhì)、免疫原性等方面進(jìn)行比較,研

5、究其作為新型亞單位鼠疫疫苗候選抗原的可行性。
　　大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、技術(shù)操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn),是最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。本研究在我們課題組先前已進(jìn)行的―V抗原在大腸桿菌系統(tǒng)中的高效表達(dá)‖研究基礎(chǔ)上,考慮到V來(lái)自于原核細(xì)胞,分子量比較適中,選擇利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)突變體[2]。首先采用融合PCR的方法,將273位的半胱氨酸密碼子進(jìn)行缺失突變,構(gòu)建了突變體的基因,將PCR產(chǎn)物克隆到pMD-

6、18T載體上進(jìn)行核苷酸序列分析,通過(guò)VectorNTI與原始序列進(jìn)行比對(duì),確定獲得了預(yù)期的突變體基因;再將突變體基因進(jìn)行雙酶切后回收,亞克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)的相應(yīng)酶切位點(diǎn),構(gòu)建突變體的相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒;表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,符合預(yù)期后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)氨芐青霉素篩選,即獲得表達(dá)突變體的菌株;隨機(jī)挑取突變體的菌株接種到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),待菌密度OD600達(dá)到大約1.5時(shí),加入終濃度為0.4mM

7、的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),37℃誘導(dǎo)5小時(shí),取誘導(dǎo)后菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析;結(jié)果顯示,突變體蛋白獲得高效可溶表達(dá),大小約37kDa,符合預(yù)期,目的蛋白約占蛋白總量的46％[33]。
　　純化過(guò)程中,首先采用phenylsephroseFF疏水柱,捕獲目的蛋白,接著采用脫鹽柱去除鹽離子,再使用DEAE陰離子柱、phenylsephroseHP疏水柱、凝膠柱進(jìn)行精細(xì)純化,去除雜蛋白和內(nèi)素素,獲得純度大于95%的突變體Vm抗原[2]。蛋

8、白N端氨基酸序列測(cè)定顯示結(jié)果與預(yù)期完全一致。獲得純化的蛋白后,采用Westernblotting等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,表明V抗原突變體可與抗V單克隆抗體結(jié)合。進(jìn)一步比較鑒定LcrV抗原突變體與LcrV抗原在理化性質(zhì)等方面的異同。
　　在此基礎(chǔ)上,將蛋白使用氫氧化鋁佐劑進(jìn)行吸附[26],在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了免疫原性研究,通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫血清效價(jià),并比較聯(lián)合免疫組和單獨(dú)免疫組之間體液免疫反應(yīng)的差異。結(jié)果表明,Vm抗原和V抗原的免疫原性