整體調控子PhoP直接調控鼠疫耶爾森氏菌胞內生存能力的研究.pdf

1、鼠疫是一種古老的自然疫源性疾病，是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)引起的。機體感染早期，鼠疫菌能在巨噬細胞內存活并繁殖，是鼠疫菌致病的關鍵階段。PhoP-PhoQ是一種二元調控系統(tǒng)，它可以調控細菌的毒力，參與細菌對Mg2+限制性生長環(huán)境的適應，而且還可以調節(jié)幾種革蘭氏陰性細菌的許多細胞活性。研究發(fā)現(xiàn)△phoP突變株對小鼠J774巨噬細胞感染力下降，對巨噬細胞殺(抑)菌機制(酸脅迫、過氧化氫刺激、高滲脅迫、抗菌肽作用)敏感性大大增強。雖

2、然毒力和生化表型實驗證明了PhoP-PhoQ控制著鼠疫菌胞內寄生能力，但是PhoP-PhoQ如何控制這個過程的機制至今尚未闡明。 本研究首先利用基于Red系統(tǒng)的一步法突變技術缺失替換鼠疫菌的phoP基因，進而利用鼠疫菌全基因組DNA芯片進行基因轉錄調控研究。通過比較△phoP突變株和野生株在低鎂條件下的轉錄水平差異，界定表達上調和下調的基因，這些基因組成了PhoP調控元，這一分析可從全基因組水平篩選出所有受PhoP-PhoQ直接

3、或間接調控的靶基因。然后，利用經典分子生化實驗和生物信息學分析，深入探究二元調控系統(tǒng)PhoP-PhoQ轉錄調控的分子機制。 用凝膠遷移實驗明確46個操縱子/基因直接受PhoP的轉錄調控。這些基因有的受PhoP的上調，有的受其下調，包括PhoP調控的各方面功能的基因。PhoP正調控mgtCB，后者可以調節(jié)Mg2+的轉運；通過調節(jié)氧化應激基因、分子伴侶和ATP-依賴性蛋白酶基因以及其他應激基因來參與菌體的應激防御機制；通過正調控gl

4、gPACXB操縱子來參與恢復高滲條件下細胞漿的體積、正調控pmrHFIJKLM和ugd基因來實現(xiàn)脂質A的氨基阿拉伯糖修飾、調控代謝相關基因來參與鼠疫菌能量代謝、大分子和小分子的降解以及氨基酸、嘌呤、嘧啶、核苷酸、輔基和脂肪酸生物合成等。值得注意的是，鼠疫菌的PhoP能對包括其自身在內的八個調節(jié)基因，phoP、crp、lacI、phoB、cyaA、ntrB、slyA和glnK，進行直接調控從而發(fā)揮更大的級聯(lián)作用。因此，二元調控系統(tǒng)PhoP

5、-PhoQ應當是鼠疫菌的一個整體調控子。 為了明確PhoP的精細調控機制，本研究對26個凝膠遷移實驗陽性的基因的啟動子進行了足跡實驗，得到了25個PhoP結合保護區(qū)域，在這個區(qū)域內存在著PhoPbox，PhoP蛋白調控靶基因主要是通過結合各靶基因啟動子內的PhoPbox，調控各基因的轉錄。用motifsampler軟件對這25個結合保護區(qū)域進行同源比對，并從統(tǒng)計學角度分析了18個位置上的堿基分布情況，最終將鼠疫菌的PhoPbox

6、歸納為(T/G)(A/G)TTTA(A/T)七核苷酸同向重復序列。但PhoPbox存在著多種形式，根據串聯(lián)重復序列的基序拷貝數和是否含有-35序列，將啟動子結構特征歸納為六種表現(xiàn)形式。 PhoP-PhoQ調控鼠疫菌的胞內寄生能力，在巨噬細胞的吞噬溶酶體內PhoP-PhoQ能夠感應細胞內低鎂環(huán)境，誘導有利于胞內存活的基因轉錄。本研究通過比較轉錄組和經典的分子生化實驗初步證明了鼠疫菌抵抗巨噬細胞的殺/抑菌機制：PhoP激活mgtCB

7、基因的表達，通過mgtB轉運系統(tǒng)調控的Mg2+的轉運，維持菌體的鎂環(huán)境自穩(wěn)態(tài)，最終保證鼠疫菌的正常生理活動需要；激活解毒酶基因、分子伴侶和ATP-依賴性蛋白酶基因、DNA結合蛋白基因以及一些通用蛋白基因的表達，代謝大量的02和H202，并抵抗低pH環(huán)境，保護蛋白和DNA免受損傷；通過激活脂質A修飾酶基因的表達將氨基阿拉伯糖添加至脂質A的磷酸基團上，干擾抗菌肽與磷酸基團的結合。 本研究首次在鼠疫菌中確定了二元調控系統(tǒng)PhoP-Ph