鼠疫耶爾森氏菌多重PCR-微孔板雜交-EIA檢測技術(shù)的研究.pdf

1、目的:建立鼠疫耶爾森氏菌防污染多重PCR—微孔板雜交—EIA檢測鑒定技術(shù)用于鼠疫耶爾森氏菌的快速檢測鑒定.方法:針對分別存在于鼠疫耶爾森氏菌pMT1和pPCP1質(zhì)粒上的毒力基因caf1和pla,以及一段276bp染色體序列3a分別設(shè)計(jì)引物,其中上游引物5'-末端生物素標(biāo)記,建立多重PCR反應(yīng)體系.用特別設(shè)計(jì)的三對引物制備捕獲探針并分別包被聚乙烯微孔板,原則是探針的長度在400—700bp之間,且包含靶序列,以提高雜交檢測效率.待鑒定標(biāo)本

2、用生物素化的三對檢測引物多重PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系中用UNG防止產(chǎn)物污染.同時(shí)檢測caf1、3a和pla三個(gè)靶序列,相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為171、276和480bp.擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性后在預(yù)包被捕獲探針的微孔板中嚴(yán)格條件下分別雜交和漂洗.信號檢測系統(tǒng)采用鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶,以TMB作為底物,顯色反應(yīng)結(jié)束后,2MH<,2>SO<,4>中止反應(yīng)，在Hyperion Micro4酶標(biāo)儀上讀取OD450，陽陰OD比值≥2.1為陽性.結(jié)果：應(yīng)

3、用該鑒定技術(shù)對中國鼠疫耶爾森氏菌17個(gè)生態(tài)型及新發(fā)現(xiàn)的青藏高原青海田鼠疫源地菌株的檢測結(jié)果表明，多重PCR-電泳法檢測結(jié)果，54株實(shí)驗(yàn)菌株均擴(kuò)增出預(yù)期的3條產(chǎn)物帶，相關(guān)菌株均陰性，檢測靈敏度為100fgDNA;多重PCR-微孔板雜交檢測結(jié)果，20株實(shí)驗(yàn)菌株全部陽性（OD450 0.151-0.967），相關(guān)菌株均陰性（OD450 0.007-0.019）.其檢測靈敏度為10fgDNA.結(jié)論：該方法用于鼠疫耶爾森氏菌的鑒定簡便、快捷，具有