LAMP檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌.pdf

1、食品是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)。隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，食品安全越來越得到人們的廣泛關(guān)注。這與食品安全事件頻發(fā)有很大關(guān)系，在這些食品安全事件中，很大一部分是由細(xì)菌性食物中毒引起的。小腸耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)是一種重要的人畜共患病病原菌，在自然界中分布十分廣泛，并且它不怕低溫，是能在冷藏溫度下生長的少數(shù)幾種腸道致病菌之一?？梢鹞改c道癥狀，引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼結(jié)締組織等疾

2、患，發(fā)病范圍較其它致病菌廣泛，甚至可引起敗血癥造成死亡。由于該菌屬于重要的食源性致病菌，所以該菌被列為檢測進(jìn)出口食品的常規(guī)菌種，多個(gè)國家均列入檢測范圍。
　　 檢測食品中的致病菌常采用傳統(tǒng)的手工檢測方法，涉及到富集、分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，程序極其繁瑣，且耗時(shí)較長，還無法檢測那些人工難以培養(yǎng)的微生物。與之相比，該菌的快速檢測方法更為靈敏，也更適用于日常生活中的檢測。其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-media

3、ted isothermal amplification，LAMP)最具有代表性，該方法是一種新型體外擴(kuò)增核酸的技術(shù)，具有簡便、強(qiáng)特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)用于檢測致病菌。
　　 本論文研究利用小腸耶爾森氏菌ail基因作為目標(biāo)基因，充分利用應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，選出一套LAMP引物，用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，確定25μL反應(yīng)體系為:10×Bst DNA聚合酶緩沖液2.5μL

4、，dNTPs、MgC12各2.0μL，內(nèi)引物FIP和BIP各3.0μL，外引物F3和B3各0.5μL，8 U/μL的Bst DNA聚合酶0.6μL， DNA模板2μL，滅菌水補(bǔ)足25μL體系。反應(yīng)在63℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min，后在80℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)5 min使Bst DNA聚合酶失活以使反應(yīng)終止，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:通過直接觀察，看有無白色焦磷酸鎂沉淀生成，從而初步判斷反應(yīng)是否發(fā)生，若發(fā)生，則通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果。

5、r>　　 本研究共檢測了10株菌，結(jié)果顯示:1株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌為陽性;其它菌均為陰性結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果表明引物特異性強(qiáng)。本方法確定了檢測該菌的靈敏度、人工污染檢出限，并且與普通的PCR檢測方法做了比較。LAMP檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靈敏度為101 CFU/mL，受到人工污染的豬肉樣品的檢出限為102 CFU/mL。檢測該菌的靈敏度和人工污染檢出限，均高于PCR檢測方法。比較了4種人工污染豬肉中模板DNA提取方法，選取了一種快捷、