小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica0)快速檢測體系的建立及應用.pdf

1、小腸結腸炎耶爾森菌是一種人畜共患病病原菌，主要寄生于健康豬的因喉部位，可以通過食品等途徑傳染給人，導致食物中毒，對人類造成很大的威脅。
　　 本論文先通過普通PCR方法的建立確定特異性較高的引物，再通過對小腸結腸炎耶爾森菌前增菌液的選擇確定樣品中本菌的增菌方法，最后再利用內(nèi)部擴增質(zhì)控技術通過一系列試驗建立小腸結腸炎耶爾森菌實時熒光PCR檢測體系，為鮮肉中小腸結腸炎耶爾森菌快速檢測提供有效的技術手段和方法。本文分三部分進行研究闡述

2、。
　　 1.小腸結腸炎耶爾森菌普通PCR反應的建立
　　 本試驗根據(jù)小腸結腸炎耶爾森菌的ail基因進行三對普通PCR反應引物的選擇、特異性、靈敏性，以及反應的退火溫度試驗。同時將毒力基因ail與16s rDNA組合進行雙重PCR反應。最后通過實時熒光PCR反應進行進一步驗證。試驗結果表明aill引物特異性較高，靈敏性好，是本菌進行PCR擴增的適宜引物。
　　 2.小腸結腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇
　　

3、 小腸結腸炎耶爾森菌作為一種食源性致病菌逐漸引起了關注。本實驗利用胰蛋白胨培養(yǎng)基、改良磷酸鹽緩沖液和氯苯酚-替卡西林-氯酸鉀培養(yǎng)基分別對小腸結腸炎耶爾森菌前增菌，并采用實時熒光PCR方法對增菌效果進行檢驗。結果表明：在純菌體系中胰蛋白胨培養(yǎng)基對小腸結腸炎耶爾森菌的增菌作用優(yōu)于其他兩種培養(yǎng)基，并且增菌24h后即可檢測到該菌。在混菌體系中小腸結腸炎耶爾森菌經(jīng)過改良磷酸鹽緩沖液增菌后靈敏性最高，并且增菌時間可縮短至8h。因此在實際檢測中可采用

4、改良磷酸鹽緩沖液對本菌進行增菌檢測。
　　 3.小腸結腸炎耶爾森菌實時熒光PCR方法的建立
　　 本試驗利用小腸結腸炎耶爾森菌的毒力基因ail作為目的基因進行小腸結腸炎耶爾森菌實時熒光PCR反應，并且以大米的gos基因作為內(nèi)部擴增質(zhì)控基因進行小腸結腸炎耶爾森菌的雙重實時熒光PCR方法的建立。利用建立的雙重實時熒光PCR方法對從屠宰場取樣的32份下顎淋巴結和38份舌頭及扁桃體進行檢測.試驗結果表明，單重和雙重實時熒光PCR

5、方法特異性均較高，檢測限分別為10pg/μL和100pg/μL。在實際樣品檢測時傳統(tǒng)生化培養(yǎng)鑒定方法檢出率為5.71％，單重和雙重實時熒光PCR方法檢出率分別為44.29％和8.57％。雙重實時熒光PCR方法中各樣品的內(nèi)控基因均有擴增曲線產(chǎn)生，這說明該反應中無抑制PCR物質(zhì)存在。所有傳統(tǒng)方法檢出樣品均被實時熒光PCR方法檢出，這說明本方法檢出時間快且檢出率高。
　　 綜上所述，本文選擇出一對特異性較高的小腸結腸炎耶爾森菌引物，通