鼠疫耶爾森菌體內(nèi)外sRNAs的鑒定與毒力相關(guān)sRNAs初步篩選.pdf

1、目的:
　　 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多細(xì)菌中的非編碼小RNA(smallnon-codingRNAs，sRNAs)被發(fā)現(xiàn)。這些sRNAs不編碼蛋白質(zhì)，而作為基因表達(dá)關(guān)鍵調(diào)控因子，有利于宿主-細(xì)菌之間的相互作用，并在病原體生存的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。本研究旨在發(fā)現(xiàn)鼠疫耶爾森菌體新的sRNAs及其對毒力影響，揭示鼠疫菌在體外生長和體內(nèi)感染期間相關(guān)sRNAs的表達(dá)模式，便于將來研究鼠疫耶爾森菌的sRNAs及其功能。

2、>　　 方法:
　　 1.RNA測序和信息學(xué)分析:分別提取四種條件，TMH培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、肺鼠疫模型小鼠肺和小鼠脾內(nèi)的鼠疫耶爾森菌總RNA，回收50～500ntRNA片段，進(jìn)行Solexa測序。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，篩選位于基因間區(qū)或反義鏈上，且存在于兩個(gè)及兩個(gè)以上樣品的轉(zhuǎn)錄本，作為候選sRNAs。
　　 2.候選sRNAs特征的證實(shí):針對上述獲得的候選sRNAs信息，設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄制備地高辛標(biāo)記

3、的RNA探針，通過Northernblot實(shí)驗(yàn)檢測候選sRNAs存在、大小和穩(wěn)定性;通過引物延伸實(shí)驗(yàn)來確定這些高豐度表達(dá)sRNAs的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
　　 3.候選sRNAs差異表達(dá)的證實(shí):每個(gè)RNA樣品，用特異性引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，分析比較候選sRNAs在體內(nèi)外條件下差異表達(dá)情況;通過Northernblot實(shí)驗(yàn)檢測候選sRNAs在體外條件下差異表達(dá)情況。
　　 4.鼠疫菌sR

4、NAs缺失突變株的構(gòu)建:我們篩選部分高表達(dá)的sRNAs，采用λRed同源重組技術(shù)制備鼠疫耶爾森菌sRNAs缺失突變株。
　　 5.表型實(shí)驗(yàn)和小鼠感染實(shí)驗(yàn):通過觀察菌落形態(tài)和體外生長，比較鼠疫菌野生株和sRNAs突變株的體外生長相關(guān)的表型變化;鼠疫菌野生株和sRNAs突變株分別接種于BHI培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)至對數(shù)中期，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1hr。大約100個(gè)CFU鼠疫菌皮下注射感染6周齡的BALB/c小鼠，觀察14天的死亡情況。
　

5、　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)RNA測序和數(shù)據(jù)分析，最終發(fā)現(xiàn)了104個(gè)鼠疫耶爾森菌的非編碼sRNAs，包括26個(gè)在其他基因組中已經(jīng)注釋的和78個(gè)新發(fā)現(xiàn)的sRNAs。
　　 2.Northernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了14個(gè)新的小RNA存在，轉(zhuǎn)錄本長度與RNA測序得到的長度基本吻合，并對sR034等6個(gè)sRNAs的大小和穩(wěn)定性進(jìn)行了初步驗(yàn)證;引物延伸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功確定了兩個(gè)sRNAs(sR034和sR035)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，

6、與RNA測序結(jié)果基本一致。
　　 3.經(jīng)qRT-PCR證實(shí)，發(fā)現(xiàn)CsrB，CsrC，4.5SRNA和sR027等4個(gè)sRNAs在感染小鼠肺臟中表達(dá)下調(diào)。
　　 4.成功構(gòu)建了sR035等9個(gè)鼠疫菌sRNAs缺失突變株。
　　 5.表型實(shí)驗(yàn)證實(shí)sRNAssR084、sR035和sR088缺失株菌落呈現(xiàn)光滑表型;小鼠毒力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，已知毒力相關(guān)sRNAssrA缺失突變株的毒力減弱，其他5個(gè)sRNAs缺陷變異株沒有減毒。