EZH2調(diào)控BRCA1促進上皮性卵巢癌惡性生物學進展及上皮性卵巢癌石蠟標本實時定量PCR實驗最適內(nèi)參基因鑒定的研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分：EZH2調(diào)控BRCA1促進上皮性卵巢癌惡性生物學進展目的：探討在上皮性卵巢癌細胞中果蠅zeste基因增強子同源物2（EZH2）能否調(diào)控乳腺癌第一易感基因（BRCA1）的表達及其調(diào)控機制，明確BRCA1在EZH2介導的卵巢癌惡性生物學進展中的作用，從而找到抑制腫瘤進展的靶點。
　　方法：構(gòu)建兩個靶向沉默EZH2基因的短發(fā)夾RNA(shEZH2)質(zhì)粒表達載體，脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至上皮性卵巢癌

2、細胞A2780，瞬時轉(zhuǎn)染至ES2和SKOV3細胞。實時熒光定量PCR(qPCR)、免疫印跡和細胞免疫化學法檢測下調(diào)EZH2后BRCA1在mRNA和蛋白水平的表達及細胞核內(nèi)外分布情況。胰島素樣生長因子1（IGF-1）處理細胞活化AKT1，細胞免疫化學法再次檢測EZH2和BRCA1的表達及核內(nèi)外分布情況?；瘜W合成三個靶向沉默BRCA1的小干擾RNA（siRNA），檢驗干擾效率后，脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染了shEZH2和空白對照組細胞中，MTT

3、、Transwell小室法和流式細胞儀分別檢測下調(diào)BRCA1表達對EZH2沉默所引起的卵巢癌增殖、遷移和細胞周期改變的影響。在順鉑耐藥細胞中聯(lián)合或單獨沉默EZH2和BRCA1的表達，MTT法檢測各組細胞對順鉑敏感性的變化。
　　結(jié)果：1、上皮性卵巢癌細胞A2780、ES2和SKOV3中成功抑制EZH2表達后，BRCA1在mRNA水平上表達較對照組下調(diào)，而在蛋白水平上明顯升高，并且存在由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢。
　　2、在轉(zhuǎn)染s

4、hEZH2的A2780細胞中成功激活AKT1表達阻斷了BRCA1蛋白的胞漿胞核轉(zhuǎn)移效應。
　　3、沉默EZH2的A2780和ES2細胞中聯(lián)合敲出BRCA1基因后，細胞的增殖遷移能力較未聯(lián)合敲出BRCA1基因組增強。
　　4、卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780/DDP中聯(lián)合沉默EZH2與BRCA1表達未能疊加單獨沉默二者產(chǎn)生的細胞順鉑增敏作用。
　　結(jié)論：上皮性卵巢癌細胞中EZH2能調(diào)控BRCA1的表達及胞漿/胞核轉(zhuǎn)移，該調(diào)控

5、能被活化的AKT1所阻斷。BRCA1下調(diào)能部分逆轉(zhuǎn)EZH2引起的卵巢癌惡性生物學行為，提示BRCA1在EZH2發(fā)揮原癌基因的作用中起重要作用。
　　第二部分：上皮性卵巢癌石蠟標本實時定量PCR實驗最適內(nèi)參基因的鑒定目的：篩選上皮性卵巢癌石蠟標本實時熒光定量PCR實驗最適內(nèi)參基因。
　　方法：以real-time PCR和ovarian cancer兩個關(guān)鍵詞在Pubmed查得2010年1月到2013年3月共計128篇全文獲取

6、十二個常用的管家基因（ACTB,GAPDH,18S rRNA,GUSB,PPIA, PBGD,PUM1,TBP,HRPT1,RPLP0,RPL13A和B2M），收集上皮性卵巢組織標本（正常、良性、交界性和惡性）共計五十例，運用激光顯微切割技術(shù)獲取同質(zhì)性上皮性卵巢組織用于后續(xù)研究。實時定量PCR所得實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析或非參檢驗進行分析。NormFinder和geNorm兩個軟件進一步用于驗證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和實用性。
　　

7、結(jié)果：上皮細胞在正常卵巢組織中占很小比例。候選內(nèi)參基因中ACTB,PPIA,RPL13A,RPLP0和TBP不受疾病進展影響而在正常、良性、交界性和惡性上皮標本中相對穩(wěn)定表達，其中NormFinder和geNorm驗證得出ACTB,PPIA,RPLP0和TBP的穩(wěn)定組合，而最常用內(nèi)參基因GAPDH在卵巢上皮細胞中的表達不穩(wěn)定，在癌組織中的表達顯著高于其他三類組織。
　　結(jié)論：在上皮性卵巢腫瘤研究中推薦同質(zhì)性上皮組織的使用和實時定量