人膽囊癌干細(xì)胞的分離、鑒定及其惡性生物學(xué)行為的調(diào)控研究.pdf

1、第一部分體外無(wú)血清培養(yǎng)膽囊癌懸浮細(xì)胞球及其生物學(xué)特性研究
　　 目的：通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增膽囊癌懸浮細(xì)胞球并分析其生物學(xué)特性，明確其中是否富含有腫瘤干細(xì)胞，并初步篩選其細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　 方法：將人原代膽囊癌組織和膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD 消化制成單細(xì)胞懸液，置入含有多種細(xì)胞因子的無(wú)血清培養(yǎng)液DMEM／F12中培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞克隆球；將培養(yǎng)出腫瘤細(xì)胞克隆球給予傳代擴(kuò)增；并將其置入含有血清的分化環(huán)境中貼壁培養(yǎng)，14天后實(shí)時(shí)定

2、量RT-PCR檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4和Nestin的表達(dá)；MTT 法檢測(cè)克隆球細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的增殖能力和對(duì)化療藥的敏感性，并植入裸鼠皮下比較移植瘤形成能力；用流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD24、CD44、CD133在克隆球細(xì)胞和貼壁細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：人原代膽囊癌細(xì)胞和GBC-SD細(xì)胞均可在干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中長(zhǎng)出克隆球，并可以連續(xù)傳代形成新的克隆球；克隆球細(xì)胞在含血清的環(huán)境中出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)并分散開，克隆球漸變小最后

3、消失，同時(shí)干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4和Nestin的表達(dá)下調(diào)；與貼壁細(xì)胞相比，克隆球細(xì)胞在體外具有強(qiáng)的增殖、耐受吉西他濱和5-氟尿嘧啶和在裸鼠皮下形成新的移植瘤能力；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，CD133+細(xì)胞在克隆球細(xì)胞中的比例高于在貼壁細(xì)胞中的比例。
　　 結(jié)論：人原代膽囊癌細(xì)胞和GBC-SD細(xì)胞中存在腫瘤干細(xì)胞，可以通過在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到一定程度的擴(kuò)增，CD133 蛋白可能為其細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　 第二部分膽囊癌干細(xì)胞

4、的分離及生物學(xué)特性鑒定
　　 目的：用細(xì)胞表面標(biāo)志物CD24、CD44、CD133分離出膽囊癌亞群細(xì)胞并進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞特性分析，鑒定出膽囊癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　 方法：將新鮮的人膽囊癌組織標(biāo)本切成小塊后置入裸鼠皮下建立裸鼠荷瘤模型，為下一步研究提供膽囊癌標(biāo)本材料；將膽囊癌組織和GBC-SD細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，標(biāo)上抗人CD24-FITC、CD44-APC和CD133-PE 流式抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并分離出CD24+、CD

5、44+和CD133+細(xì)胞，進(jìn)一步研究各亞群的生物學(xué)特性；將具有腫瘤干細(xì)胞特性的亞群標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)、分選亞群細(xì)胞及研究生物學(xué)特性包括在無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境中克隆形成球、對(duì)化療藥吉西他濱和5-氟尿嘧啶的敏感性、在NOD/SCID 鼠體內(nèi)形成異種移植瘤能力及體內(nèi)自我更新、分化潛能。
　　 結(jié)果：新鮮的人膽囊癌組織標(biāo)本植入裸鼠皮下3～6月后大部分裸鼠成功長(zhǎng)出移植瘤；經(jīng)流式分析CD24+、CD44+和CD133+細(xì)胞在原代膽囊癌和GBC-SD細(xì)

6、胞中的比例分別為：20.83％~35.72％和55.73％，78.19％~93.36％和96.78％，1.93％~3.43％和61.28％；經(jīng)生物學(xué)特性研究，CD24+和CD24－細(xì)胞在形成克隆球、移植瘤形成能力上沒有明顯差別，差異性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CD44+和CD133+細(xì)胞在形成克隆球、移植瘤形成能力上均明顯強(qiáng)于相應(yīng)的陰性亞群；流式進(jìn)一步檢測(cè)觀察到CD44＋CD133＋細(xì)胞在原代腫瘤和GBC-SD細(xì)胞中的比例為2.53％和 60.

7、62％，且CD44＋CD133＋細(xì)胞較CD44＋CD133－細(xì)胞具有更強(qiáng)的形成克隆球、耐受化療和移植瘤形成能力；經(jīng)流式分析和免疫組化檢測(cè)CD44＋CD133＋細(xì)胞形成的移植瘤細(xì)胞中，既有CD44+和CD133+細(xì)胞，也含有CD44－和CD133－細(xì)胞。
　　 結(jié)論：人膽囊癌CD44＋CD133＋細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性，其中富集有腫瘤干細(xì)胞，CD44和CD133 可用來(lái)分離膽囊干細(xì)胞。
　　 第三部分 CD133 特異s

8、iRNA 對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及核轉(zhuǎn)錄因子Gli在膽囊癌細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的：通過運(yùn)用RNAi 干擾技術(shù)沉默膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD的CD133的表達(dá)，研究其對(duì)GBC-SD細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，研究核轉(zhuǎn)錄因子Gli在膽囊癌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 方法：將CD133 特異性siRNA 轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD，并運(yùn)用Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析并優(yōu)化轉(zhuǎn)染的效率和效果；在無(wú)血清環(huán)境中檢測(cè)其克隆球形

9、成能力，運(yùn)用MTT分析其體外增殖和對(duì)5-氟尿嘧啶的耐受性，以細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞遷徙能力；運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3在膽囊癌不同亞群中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：特異性siRNA 轉(zhuǎn)染后，經(jīng)Western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析，膽囊癌細(xì)胞株GBC-SD的CD133表達(dá)明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染CD133 特異性siRNA組細(xì)胞較空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組細(xì)胞，其細(xì)胞克隆球形成能力、細(xì)胞增殖能