膽囊癌組織相關(guān)蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、背景： 原發(fā)性膽囊癌是惡性程度非常高的腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，晚期膽囊癌5年生存率低于5％，而早期膽囊癌預(yù)后較好，5年生存率可高于80％，但無特異性臨床表現(xiàn)，早期診斷困難，缺乏特異的診斷標(biāo)志，臨床上發(fā)現(xiàn)的早期膽囊癌多為意外性膽囊癌。膽囊結(jié)石并慢性膽囊炎是膽囊癌公認(rèn)的危險(xiǎn)因子，單個(gè)結(jié)石直徑＞3em是導(dǎo)致膽囊癌發(fā)生的重要原因。膽囊癌合并有膽囊結(jié)石發(fā)生率可高達(dá)94％。結(jié)石嵌頓引起膽管阻塞使膽汁淤積引起膽囊黏膜慢性炎癥、增生與膽囊

2、癌的癌變過程有千絲萬縷的關(guān)系。 研究目的： 在蛋白質(zhì)組學(xué)水平篩選和鑒定與膽囊癌致病相關(guān)的差異蛋白，以期找到與膽囊癌診斷、治療、預(yù)后相關(guān)的特異性標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)膽囊癌診療的新穎靶點(diǎn)，更好的探討和了解膽囊癌的發(fā)病機(jī)理。 研究方法： 本研究運(yùn)用成熟的雙向電泳．質(zhì)譜鑒定技術(shù)，在10例原發(fā)性膽囊癌中，以膽囊結(jié)石并慢性膽囊炎、正常膽囊組織和部分癌旁正常膽囊組織作為對(duì)照，進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，選取有代表的三次二維電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，

3、通過兩兩比較，滿足組間三次平行電泳實(shí)驗(yàn)平均值±SD差大于2倍的條件，被認(rèn)為差異表達(dá)，以此為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白表達(dá)點(diǎn)。選取依照膽囊組．癌前病變組．正常對(duì)照組或有下調(diào)趨勢(shì)，或有上調(diào)趨勢(shì)的差異表達(dá)點(diǎn)進(jìn)行PMF-MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定工作，鑒定的標(biāo)準(zhǔn)包括分子量、等電點(diǎn)、質(zhì)譜檢測(cè)肽段在整個(gè)蛋白質(zhì)中的覆蓋率、匹配度分值，蛋自得分大于56被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。鑒定數(shù)據(jù)經(jīng)MASCOT檢索，明確蛋白名稱。在此基礎(chǔ)上，選取部分感興趣

4、的上調(diào)和下調(diào)蛋白運(yùn)用Realtime-PCR及其Western印跡方法從mRNA水平及蛋白質(zhì)水平兩個(gè)方面進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。最后，選取有潛在意義的蛋白在大樣本的膽囊癌組織芯片中，進(jìn)行免疫組化表達(dá)驗(yàn)證。以探討蛋白之間的相關(guān)性以及與膽囊癌的臨床病理學(xué)行為的關(guān)系及意義。 結(jié)果： 第一部分雙向電泳試驗(yàn)中，以膽囊結(jié)石并慢性膽囊炎和正常膽囊、癌旁組織為對(duì)照，共尋找到66個(gè)與膽囊癌相關(guān)的差異表達(dá)點(diǎn)，其中在膽囊癌中上調(diào)表達(dá)點(diǎn)21個(gè)，下調(diào)表達(dá)點(diǎn)

5、45個(gè)。26個(gè)蛋白差異點(diǎn)入選質(zhì)譜鑒定工作，鑒定出21個(gè)差異表達(dá)蛋白(部分蛋白重復(fù))，其中在膽囊癌中上調(diào)表達(dá)的10個(gè)，包括：膜聯(lián)蛋白A4，膜突蛋白，人纖維蛋白素原β鏈，肌凝蛋白、肌動(dòng)蛋白-胞質(zhì)2、放射相關(guān)性蛋白3，血清白蛋白：下調(diào)的蛋白11個(gè)：血紅蛋白β亞基，肌動(dòng)蛋白-大血管平滑肌，原肌凝蛋白α-1鏈，(肌動(dòng)蛋白)凝溶膠蛋白，凝膠溶素膠原α-1(Ⅵ)鏈，超(過)氧化物歧化酶[銅-鋅]，半乳凝素-1，角蛋白Ⅱ型細(xì)胞支架，(中間絲)波形蛋白，

6、視黃醛脫氫酶1，熱休克蛋白HSP-90-β。其中下調(diào)蛋白視黃醛脫氫酶1為新穎發(fā)現(xiàn)，未見其與腫瘤的相關(guān)報(bào)道。 第二部分我們選取上調(diào)蛋白膜聯(lián)蛋白A4(AnnexinA4)、膜突蛋白(Moesin)及下調(diào)蛋白視黃醛脫氫酶1Retinal dehydrogenasel、熱休克蛋白90(Heat shock protein HSP90-beta)、波形蛋白(Vimentin)經(jīng)Realtime-PCR及WesternBlot驗(yàn)證，結(jié)果表明

7、：膜聯(lián)蛋白A4及膜突蛋白在癌組織標(biāo)本中有高于對(duì)照組表達(dá)的趨勢(shì)，而視黃醛脫氫酶1在對(duì)照組中的表達(dá)有高于癌組織組的趨勢(shì)。由于樣本量少，在這部分中我們僅能做一個(gè)趨勢(shì)的判斷。最后AnnexinA4、Moesin及Retinaldehydrogenasel入選進(jìn)入大樣本(59例)膽囊癌組織芯片免疫組化驗(yàn)證，結(jié)果表明：在慢性膽囊炎及癌旁組織中ALDH1A1陽性表達(dá)，而AnnexinⅣ和Moesin呈陰性或?yàn)槿蹶栃员磉_(dá)，在59例膽囊癌組織中，ALDH

8、1A1，AnnexinⅣ和Moesin三者的表達(dá)率分別為62.7％(37/59)、42.4％(25/59)和35.6％(21/59)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明慢性膽囊炎、癌旁組織、膽囊癌組織中三者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。分析三者的表達(dá)關(guān)系與膽囊癌的臨床病理聯(lián)系表明：Moesin陽性表達(dá)與性別(男)、浸潤深度、肝臟轉(zhuǎn)移以及疾病進(jìn)展呈正相關(guān)，AnnexinⅣ與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展高度相關(guān)，而ALDH1A1疾病進(jìn)展和組織分化呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)三

9、者存在著Moesin與ALDH1A1呈負(fù)相關(guān)，Moesin與AnnexinⅣ呈正相關(guān)，而ALDH1A1與AnnexinⅣ無相關(guān)性的表達(dá)關(guān)系。 結(jié)論： 我們的結(jié)果提示：Moesin和AnnexinⅣ有可能成為膽囊癌診斷或生物治療的新穎靶點(diǎn)，其中，Moesin蛋白可能與雌激素受體相關(guān)的膽囊癌又千絲萬縷的關(guān)系。我們第一次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道ALDH1A1蛋白在抑制膽囊癌的生長和分化中可能有重要的作用，其直接催化的產(chǎn)物維甲酸可能可以抑制膽