膽囊癌的蛋白質(zhì)組學分析及AnnexinA3-miRNA對膽囊癌細胞的生物學效應的研究.pdf

1、第一部分膽囊癌患者血清及正常人血清的蛋白質(zhì)組學分析
　　 目的：應用比較蛋白質(zhì)組學方法研究膽囊癌患者及正常人血清之間差異表達的蛋白質(zhì)，篩選膽囊癌血清標志物以及可能與膽囊癌發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì)。方法：利用雙向凝膠電泳(2-DE)對6例膽囊癌患者及6例正常人血清的總蛋白進行分離，并用質(zhì)譜儀對兩組間差異蛋白質(zhì)點進行肽指紋譜和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。利用蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組化法檢測差異蛋白在膽囊癌患者和健康人血清及組織的表達。結(jié)果：共有24個蛋白點

2、被成功鑒定。其中在膽囊癌患者血清中高表達的有12個，它們是Splicingfactor3Bsubunit5,Cystatin-B,S100A10Protein,HistoneH2Btype2-E,Profilin-1,EukaryotictranslationinitiationfactorlA,IsoformlofEukaryotictranslationinitiationfactor5A-l,FERMdomaincontainin

3、g3,haptoglobinprotein,Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,SerumamyloidP-componentprecursor,harmoninisoformb3。在膽囊癌患者血清中表達降低的有12個，分別是ApolipoproteinA-Iprecursor,Myosinregulatorylightchain2,IsoformlofProteincanopyhomolog

4、2precursor,Proteasomesubunitbetatype-2,ARHGDIA,Superoxidedismutase[Mn],IsoformlofFicolin-3precursor,zincalpha-2-glycoproteinl,HPhaptoglobinisoform2preproprotein,CD5antigen-likeprecursor,CLUclusterinisoform,ITIH471kDaprot

5、ein。Western印跡及免疫組化證實了S100A10蛋白和結(jié)合珠蛋白(haptoglobinprotein)在膽囊癌患者血清及組織中高表達。結(jié)論：以2-DE結(jié)合質(zhì)譜鑒定是血清差異蛋白質(zhì)組學研究的可靠平臺。本實驗所得的S100A10等差異表達蛋白可能是潛在的診斷膽囊癌的分子標志物或控制腫瘤生長的治療靶點。
　　 第二部分人膽囊癌組織及膽囊良性組織的蛋白質(zhì)組學分析
　　 目的：應用比較蛋白質(zhì)組學方法研究人膽囊癌組織和膽囊

6、良性組織之間差異表達蛋白質(zhì)。方法：利用雙向凝膠電泳(2-DE)對6例膽囊癌組織和6例膽囊良性組織的總蛋白進行分離，并用質(zhì)譜儀對兩組間差異蛋白質(zhì)點進行肽指紋譜和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。利用蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組化法檢測差異蛋白在膽囊癌組織和膽囊良性組織的表達。結(jié)果：共有17個蛋白點被成功鑒定。其中在膽囊癌組織中高表達的有9個，它們是AnnexinA3,Phosphatidylethanolamine-bindingproteinl(PEBP1),A

7、CTG1protein,GAPDH,Alcoholdehydrogenase,Fructose-bisphosphatealdolase,Interferon-inducedproteinwithtetratricopeptide,acyl-CoAdehydrogenase,TTRprotein;在膽囊癌組織中表達降低的有8個，分別是Superoxidedismutase,Plasmaretinol-bindingproteinprec

8、ursor,Alpha-crystallinBchain,Hemoglobin,CathepsinDprecursor,Aldo-ketoreductasefamilylmemberB10,Tripartitemotif-containing45,Serotransferrinprecursor。Westernblot和免疫組化結(jié)果顯示差異表達蛋白AnnexinA3和Phosphatidylethanolamine-bindingpro

9、teinl(PEBP1)在膽囊癌組織中表達上調(diào)，與2-DE結(jié)果一致。結(jié)論：以2-DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學技術(shù)是腫瘤研究的一種重要手段。本實驗所得的AnnexinA3、PEBP1等差異表達蛋白可能成為潛在的診斷膽囊癌的分子標志物或控制腫瘤生長的治療靶點。
　　 第三部分AnnexinA3-miRNA對膽囊癌細胞的生物學效應的研究
　　 目的：構(gòu)建針對AnnexinA3的miRNA真核表達載體，并導入膽囊癌細胞，探討其對Ann

10、exinA3基因的干擾作用以及對膽囊癌細胞生物學效應。方法：人工合成AnnexinA3-miRNA的寡核苷酸鏈，將其插入到pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR載體中；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建重組體導入人膽囊癌細胞系SGC-996中；采用實時熒光定量PCR(Real-TimePCR)、免疫印跡法(Westernblot)分別檢測轉(zhuǎn)染細胞AnnexinA3mRNA和蛋白的表達變化。采用細胞計數(shù)法檢測實驗組和對照組SGC-996細胞的增

11、殖：用流式細胞術(shù)(FCM)檢測轉(zhuǎn)染AmexinA3-miRNA載體的SGC-996細胞周期及凋亡；用細胞劃痕實驗觀察各組SGC-996細胞的隨意運動能力的變化；利用Transwell小室測定轉(zhuǎn)染AnnexinA3-miRNA載體的SGC-996細胞的穿膜侵襲力。結(jié)果：成功構(gòu)建了AnnexinA3的miRNA真核表達載體AnnexinA3-miRNA；轉(zhuǎn)染AnnexinA3-miRNA載體后，SGC-996細胞AnnexinA3mRNA和

12、蛋白表達均較對照組明顯下降(p<0.05)。實驗組SGC-996細胞增殖較對照組明顯減慢(P<0.05)。干擾前后細胞周期無明顯差異(P>0.05)，但細胞凋亡明顯增加(P<0.05)。干擾后膽囊癌細胞遷移能力明顯下降(p<0.05)。實驗組穿過基底膜的侵襲細胞數(shù)量明顯少于對照組(p<0.01)。結(jié)論：AnnexinA3-miRNA真核表達載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染SGC-996細胞后獲得穩(wěn)定表達，并可特異性封閉AnnexinA3的表達。該載體