Gankyrin對(duì)甲狀腺乳頭狀癌生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，近20年來(lái)呈不斷上升的趨勢(shì)。甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是甲狀腺癌最為常見(jiàn)的類(lèi)型，占所有甲狀腺癌的80-90％。盡管PTC因分化程度高、生長(zhǎng)緩慢而預(yù)后良好，但是腫瘤因受到包膜外生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及年齡、性別等多種危險(xiǎn)因素的影響，仍有10％的病人因復(fù)發(fā)和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而預(yù)后較差。部分遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人由于喪失了攝碘能力而失去碘131治療的機(jī)會(huì)，10年生存率不到10％。因此探索一些新的潛在的PTC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是十

2、分有必要的。
　　Gankyrin又稱(chēng)為PSMD10、p28Gank、Nas6p，屬于錨蛋白家族成員，是26S蛋白酶體19S調(diào)節(jié)顆粒的一個(gè)非催化亞基，2000年Higashitsuji在肝癌組織發(fā)現(xiàn)其癌基因的角色并命名為Gann ankyrin repeats（gann在日語(yǔ)的意思是cancer）Gankyrin可以通過(guò)與依賴(lài)性蛋白激酶(CDK)及鼠雙微體基因表達(dá)蛋白MDM2相結(jié)合負(fù)性調(diào)控抑癌蛋白p53和RB從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，

3、抑制其凋亡。此外，Gankyrin可以與NF-κ B等炎癥因子相互作用，提示其在炎癥免疫反應(yīng)中亦扮演著重要的角色。據(jù)報(bào)道Gankyrin在多種消化道腫瘤及乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、脂肪肉瘤等腫瘤中表達(dá)異常增高，并與原發(fā)腫瘤的大小、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。關(guān)于Gankyrin在PTC的研究目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　目的：
　　檢測(cè)Gankyrin在PTC、橋本氏甲狀腺炎(HT)及正常甲狀腺組織的表達(dá)情況并探討Gankyrin

4、蛋白表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系;分析Gankyrin在PTC及HT同向改變的意義，為兩種疾病的關(guān)系提供新的證據(jù);觀(guān)察Gankyrin沉默后對(duì)PTC細(xì)胞增殖及遷移的影響并分析其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、甲狀腺不同組織標(biāo)本取自臺(tái)州市立醫(yī)院腫瘤外科，術(shù)中切取0.5cm以上新鮮標(biāo)本一半置于10％的甲醛固定，一半放于-80℃冰箱冰凍保存。人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株CGTHW-3購(gòu)買(mǎi)于A(yíng)TCC。
　　2、實(shí)時(shí)熒光定量P

5、CR(Real-t ime PCR)、Western blot和免疫組化檢測(cè)Gankyrin在PTC、HT及正常甲狀腺組織的表達(dá)情況并分析其與PTC臨床病理特征的關(guān)系。
　　3、脂質(zhì)體法將Gankyrin干擾序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞株CGTHW-3，熒光顯微鏡下判斷大致轉(zhuǎn)染效率，并采用熒光定量PCR及western-blot檢測(cè)干擾效果。
　　4、CCK8及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gankyrin沉默后對(duì)PTC細(xì)胞增殖的影響
　　5、

6、采用細(xì)胞劃痕及transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gankyrin對(duì)PTC細(xì)胞遷移的影響。
　　6、Western blot檢測(cè)Gankyrin沉默后對(duì)p53、PI3K/AKT/PTEN信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Western-blot及Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Gankyrin在PTC及HT組織中mRNA及蛋白水平的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組（P＜0.01）;而PTC組及HT組間的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

7、P＞0.05）;
　　2、免疫組化結(jié)果表明Gankyrin在甲狀腺乳頭狀癌組織及橋本氏甲狀腺炎的的陽(yáng)性表達(dá)率分別為85.2％、80.8％，明顯高于正常甲狀腺組的陽(yáng)性表達(dá)率(14.5％)。臨床特征分析表明Gankyrin蛋白表達(dá)在PTC中的表達(dá)與患者的性別、年齡、TNM分期等無(wú)關(guān)，而與是否合并HT有關(guān)。
　　3、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察熒光發(fā)光情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率高于85％。SiRNA干擾后，與空白組及無(wú)關(guān)序列

8、組相比，Gankyrin在CGTHW-3細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（p＜0.05）。
　　4、CCk8及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gankyrin基因沉默后CGTHW-3活細(xì)胞數(shù)目及平板克隆形成能力明顯低于無(wú)關(guān)序列組（P＜0.05）。
　　5、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明干預(yù)Gankyrin表達(dá)后CGTHW-3細(xì)胞愈合及穿膜能力均明顯下調(diào)（P＜0.05)。
　　6、Western-blot結(jié)果提

9、示下調(diào)Gankyrin在CGTHW-3細(xì)胞的表達(dá)后BCL-2、PIG3、PI3K p110a亞基的蛋白表達(dá)及AKT磷酸化水平均明顯下調(diào)，而抑癌蛋白p53及PTEN的表達(dá)則明顯升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　Gankyrin在PTC組織中表達(dá)高于正常甲狀腺組織，gankyrin沉默可以抑制PTC細(xì)胞的增殖及遷移證明Gankyrin在PTC中充當(dāng)癌基因的角色。分子機(jī)制研究表明Gankyrin可能部分通過(guò)調(diào)控p53、PI3