腫瘤克隆起源之爭(zhēng)與甲狀腺乳頭狀癌研究.pdf

1、甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占人類(lèi)新發(fā)惡性腫瘤的1％。近年來(lái)，甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，最新的Cancer Statistics，2009數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)甲狀腺癌數(shù)以每年6.2％速度遞增，首次超過(guò)卵巢癌發(fā)病率成為女性第七大常見(jiàn)惡性腫瘤。
　　 甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中包含一系列高發(fā)的分子遺傳學(xué)事件，如甲狀腺濾泡狀癌中的RAS基因突變、與甲狀腺乳頭狀癌和部分甲狀腺腺瘤相關(guān)的R

2、ET/PTC基因重排、以及在甲狀腺未分化癌中常見(jiàn)的p53基因突變等。BRAF基因突變是近年來(lái)在甲狀腺癌研究領(lǐng)域最突出的進(jìn)展之一，其主要的突變方式是發(fā)生在15號(hào)外顯子的BRAFV600E突變，在甲狀腺乳頭狀癌中的平均發(fā)生率為44％。研究表明，BRAFV600E突變是甲狀腺癌發(fā)生早期的分子遺傳學(xué)事件，與腫瘤腺外浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期晚等都有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，在臨床上有很大的研究?jī)r(jià)值和運(yùn)用前景。國(guó)內(nèi)研究?jī)H停留在較小樣本的臨床病理特征比較

3、上，尚無(wú)大樣本研究隊(duì)列（超過(guò)200例）和長(zhǎng)時(shí)間臨床隨訪來(lái)研究BRAFV600E突變?cè)谥袊?guó)人群中甲狀腺癌的發(fā)生情況及預(yù)后價(jià)值。
　　 甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma, PTC)是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，其臨床特征之一是病灶多發(fā)，文獻(xiàn)報(bào)道的發(fā)生率從18％-87％不等，多灶性甲狀腺乳頭狀癌通常被認(rèn)為與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及初次治療后局部復(fù)發(fā)率高有密切關(guān)聯(lián)。雙側(cè)甲狀腺乳頭狀癌（同時(shí)性或異時(shí)性），

4、作為一種特殊類(lèi)型的多灶癌，其克隆起源尚未被報(bào)道過(guò)，該類(lèi)型的臨床病理特征也未被重點(diǎn)研究過(guò)。
　　 第一部分：BRAF基因突變?cè)谖覈?guó)甲狀腺癌人群中的研究
　　 目的：研究BRAF基因突變?cè)谖覈?guó)甲狀腺癌人群的發(fā)生情況，并進(jìn)一步探索其在預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和生存中的價(jià)值。
　　 方法：建立我院十年甲狀腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)（含甲狀腺癌1006例），進(jìn)行中位時(shí)間6年的電話隨訪和信訪（最短2.5年，最長(zhǎng)13.5年）。入組BRAF基因研究隊(duì)列含甲

5、狀腺癌220例（乳頭狀癌208例、濾泡狀癌8例、髓樣癌1例、未分化癌3例），良性甲狀腺病變46例。在比較并優(yōu)化石蠟組織基因組DNA抽提方法的基礎(chǔ)上，以直接測(cè)序法檢測(cè)BRAF基因15號(hào)外顯子的突變情況（BRAFV600E突變）。
　　 結(jié)果：BRAFV600E突變集中發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌中，突變率55.3％(115/208)：在甲狀腺癌的其他病理類(lèi)型及良性甲狀腺病變組織中均未檢測(cè)到該突變。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變與發(fā)病

6、年齡密切相關(guān)(P=0.004)；長(zhǎng)期隨訪結(jié)果顯示該突變與疾病總生存率接近統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.068)。
　　 結(jié)論：BRAFV600E突變?cè)谖覈?guó)甲狀腺癌人群同樣集中在甲狀腺乳頭狀癌，且有相對(duì)較高的發(fā)生率；另外該突變可能與甲狀腺乳頭狀癌的預(yù)后不良相關(guān)。
　　 第二部分：雙側(cè)甲狀腺乳頭狀癌的克隆起源研究
　　 目的：研究甲狀腺乳頭狀癌同時(shí)性雙側(cè)病灶及異時(shí)性復(fù)發(fā)病灶之間的克隆起源。
　　 方法：入組25對(duì)雙側(cè)甲

7、狀腺乳頭狀癌病灶（22對(duì)同時(shí)性的雙側(cè)病灶和3對(duì)異時(shí)性的復(fù)發(fā)病灶）以及15個(gè)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。以手工顯微微切割腫瘤組織，從石蠟組織抽提基因組DNA；運(yùn)用PCR和直接測(cè)序法檢測(cè)成對(duì)病灶之間的BRAF基因狀態(tài)；聯(lián)合更為準(zhǔn)確的X染色體失活分析技術(shù)判斷腫瘤克隆起源。
　　 結(jié)果：21對(duì)病例的62個(gè)病灶獲得合格的DNA樣品，18對(duì)病灶(18/21,85.7％)的BRAF基因狀態(tài)完全一致，其中BRAF基因突變組12對(duì)、BRAF基因野生型組6對(duì)。18

8、例女性病例中的11對(duì)病灶適合作X染色體失活分析，9對(duì)雙側(cè)病灶(9/11,81.1％)的X染色體失活形式相同。BRAF基因突變比較和X染色體失活分析在判斷腫瘤克隆起源結(jié)果上一致性好(Chi-Square, two-sided P=0.026； Spearman's rank correlaTiO2 test, r=0.671)。
　　 結(jié)論：基于甲狀腺癌發(fā)生相關(guān)的BRAF基因突變比較與胚胎時(shí)期就已確立的X染色體失活技術(shù)的聯(lián)合，本研

9、究首次證實(shí)甲狀腺乳頭狀癌雙側(cè)病灶（同時(shí)性和異時(shí)性）系同一克隆起源，腫瘤腺內(nèi)播散可能是雙側(cè)甲狀腺癌發(fā)生的重要原因。這一發(fā)現(xiàn)為臨床進(jìn)一步認(rèn)識(shí)甲狀腺癌的生物學(xué)行為和合理治療甲狀腺癌（甲狀腺全切）提供重要依據(jù)。
　　 第三部分：新型BRAF基因插入突變的初步研究
　　 目的：在雙側(cè)甲狀腺癌克隆起源研究中，我們通過(guò)測(cè)序篩查發(fā)現(xiàn)了一例極為罕見(jiàn)的插入型BRAF基因突變——BRAFV599Ins突變，該突變僅在一例意大利人群的甲狀腺癌病

10、人中被報(bào)道過(guò)。本部分研究擬初步探索該插入型突變可能獲得的生物學(xué)功能。
　　 方法：回顧性檢測(cè)該患者所有病灶的BRAF基因突變情況，以TA克隆確認(rèn)該突變類(lèi)型。構(gòu)建該罕見(jiàn)插入型BRAF基因突變（BRAFV599Ins突變）以及常見(jiàn)的BRAFV600E突變和BRAF基因野生型真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)后，檢測(cè)BRAF蛋白及下游ERK信號(hào)通路的表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，WST-8法(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖情