microRNA-182及TGF-β2在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:本研究首先探索microRNA-182及TGF-β2在骨肉瘤細(xì)胞與正常成骨細(xì)胞及骨肉瘤組織與其周圍正常組織中的表達(dá)是否存在差異;其次，干擾microRNA-182的表達(dá)，檢測TGF-β2的表達(dá)變化，分析microRNA-182能否引起TGF-β2的表達(dá)變化;最后，在干擾microRNA-182表達(dá)的前提下，檢測其是否能夠引起骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。
　　方法:本研究以骨肉瘤MG-63細(xì)胞系和正常成骨細(xì)胞系hFOB1.19

2、以及骨肉瘤組織及其周圍正常組織作為研究對象。首先，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測兩種細(xì)胞系及組織中microRNA-182的表達(dá)情況;免疫熒光技術(shù)（除外組織檢測）及westernblot法檢測兩種細(xì)胞系及組織中TGF-β2的表達(dá)情況。其次，對MG-63細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染并分別檢測兩種細(xì)胞系中microRNA-182及TGF-β2的表達(dá)變化，分析兩者之間的可能調(diào)控關(guān)系。最后，對MG-63細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，通過不同的檢測技術(shù)來觀察骨肉瘤細(xì)胞的活性

3、、增殖、凋亡、遷移及侵襲的變化。轉(zhuǎn)染前分組為MG-63細(xì)胞組與hFOB1.19組及骨肉瘤組織組與正常組織組，所得數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;對于MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分組為inhibitor negative control組、mimicnegative control組、microRNA-182 inhibitor組、microRNA-182 mimic組，所得數(shù)據(jù)采用方差分析及Tukey's Multiple Comparison檢

4、驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:1、提取MG-63細(xì)胞與hFOB1.19細(xì)胞及骨肉瘤組織與其周圍正常組織中的小RNA，使用qRT-PCR方法檢測microRNA-182的表達(dá)水平。結(jié)果表明，microRNA-182在MG-63細(xì)胞及骨肉瘤組織中的表達(dá)量明顯低于其在hFOB1.19細(xì)胞及正常組織中的表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05; P＜0.01）。2、使用細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值來評價TGF-β2的表達(dá)量，熒光圖像結(jié)果顯示，

5、TGF-β2在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)量與hFOB1.19細(xì)胞相比呈相對高表達(dá)狀態(tài)。使用GAPDH作為內(nèi)參，Western blot法檢測兩種細(xì)胞系及組織中TGF-β2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β2在MG-63細(xì)胞及骨肉瘤組織中的表達(dá)量與hFOB1.19細(xì)胞及正常組織相比呈相對高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01; P＜0.01）。3、MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，提取細(xì)胞中的小RNA，使用qRT-PCR的方法檢測不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染組中mi

6、croRNA-182的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，microRNA-182 inhibitor組(0.63±0.12)與inhibitor negativecontrol組(1.87±0.08)比較其表達(dá)量明顯降低;同時microRNA-182 mimic組(2.81±0.15)與mimic negative control組(1.89±0.11)相比其表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。4、MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，使用細(xì)胞的平均

7、熒光強(qiáng)度值來評價TGF-β2的表達(dá)量。熒光圖像顯示，microRNA-182 inhibitor轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達(dá)水平高于inhibitor negative control組;microRNA-182 mimic轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達(dá)水平低于mimic negative control組。提取各組MG-63細(xì)胞的蛋白樣本，使用GAPDH作為內(nèi)參，western blot法檢測TGF-β2的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，micro

8、RNA-182 inhibitor轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達(dá)量明顯高于inhibitor negative control組;microRNA-182 mimic轉(zhuǎn)染組中TGF-β2的表達(dá)量明顯低于mimic negative control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。5、MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，通過我們獲得的OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制了不同時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖曲線，與細(xì)胞活性的變化相同，表達(dá)沉默microRNA-182可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞

9、的增殖;過表達(dá)microRNA-182可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖（P＜0.05; P＜0.01）。6、MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，通過流式分析結(jié)果可知，inhibitor negative control組、mimic negativecontrol組、microRNA-182 inhibitor組以及mimic組的細(xì)胞凋亡比例分別為7.32±0.27％、7.28±0.44％、4.62±0.48％以及14.76±0.72％; microRNA-1

10、82 mimic組的細(xì)胞凋亡比例高于對照組;microRNA-182 inhibitor組的細(xì)胞凋亡比例低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05;P＜0.01)。7、MG-63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，inhibitor negativecontrol組、mimic negative control組、microRNA-182 inhibitor組、mimic組的細(xì)胞遷移數(shù)量分別為87±10、91±7、165±9、55±8個（每個視野）;inhib

11、itornegative control組、mimic negative control組、microRNA-182 inhibitor組及mimic組的細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為71±9、72±10、129±11、36±7個（每個視野）;microRNA-182 inhibitor組的細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量明顯升高(P＜0.05; P＜0.01)，因此下調(diào)microRNA-182的表達(dá)可以促進(jìn)MG-63細(xì)胞的遷移及侵襲。
　　結(jié)論:micr