LEF-1在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其對骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、背景:
　　骨肉瘤是一種侵襲力強(qiáng)、血行轉(zhuǎn)移發(fā)生早且肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率高的骨原發(fā)性惡性腫瘤,常好發(fā)于兒童和青少年。40％左右的病例出現(xiàn)遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移(主要是肺轉(zhuǎn)移)而死亡,骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移是影響患者生存的最重要原因。目前,對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。本實驗室長期致力于骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究,建立了兩株來自同一母系但具有不同轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞株:F4細(xì)胞株和F5M2細(xì)胞株,其中F4細(xì)胞具有低增殖轉(zhuǎn)移能力,F5M2細(xì)胞株具有高增殖轉(zhuǎn)移能力。同

2、時利用全基因組芯片技術(shù)對其表達(dá)譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了若干差異表達(dá)的基因,淋巴樣增強(qiáng)因子-1(lymphoid enhancer factor-1,LEF-1)就是其中的一個,提示其可能參與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。
　　Wnt信號途徑是廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中的一條在進(jìn)化上高度保守的、對控制胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有重要作用的信號傳導(dǎo)通路。其異常表達(dá)或激活會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。LEF-1作為淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(LEF/TCF)家族成員之

3、一,是Wnt信號通路重要的核內(nèi)信號分子,其主要通過募集轉(zhuǎn)錄激活因子β-catenin到Wnt靶基因,從而介導(dǎo)信號通路導(dǎo)致疾病發(fā)生。
　　目的:
　　探討LEF-1在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義;驗證LEF-1在不同轉(zhuǎn)移能力骨肉瘤細(xì)胞株(F4,F5M2)中的差異表達(dá);初步研究LEF-1對骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響,為LEF-1在骨肉瘤的早期診斷﹑靶向治療及預(yù)后預(yù)測等方面的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　

4、　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測68例原發(fā)性骨肉瘤組織和26例骨軟骨瘤組織中LEF-1蛋白的表達(dá)差異情況,并應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析其與骨肉瘤各項臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　2.采用Western-blot及quantitative RT-PCR的方法,對利用全基因組芯片篩選出來的在不同轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞株(F4,F5M2)中差異表達(dá)的LEF-1基因進(jìn)行驗證。
　　3.用RNAi干涉技術(shù)將LEF-1siRNA轉(zhuǎn)染到

5、F5M2細(xì)胞中,使用Western-blot和quantitative RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染LEF-1 siRNA后細(xì)胞中LEF-1的表達(dá)變化。
　　4.MTT法檢測干涉LEF-1的表達(dá)對骨肉瘤F5M2細(xì)胞增殖的影響。
　　5.Transwell實驗檢測干涉LEF-1的表達(dá)對骨肉瘤F5M2細(xì)胞侵襲和遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　1.LEF-1在骨肉瘤組織和骨軟骨瘤組織中的陽性表達(dá)率分別為91.2%(62/6

6、8)和11.5(3/26)。LEF-1的陽性表達(dá)率在骨肉瘤組織中明顯高于骨軟骨瘤組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。LEF-1在骨肉瘤組織中的表達(dá)與骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系。
　　2.分別采用Western-blot和quantitative RT-PCR檢測LEF-1在F4、F5M2細(xì)胞中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示LEF-1在F4、F5M2細(xì)胞中差異表達(dá),在F5M2細(xì)胞中的表達(dá)較高。
　　3.成功利用RNAi干涉技術(shù)將LE

7、F-1siRNA轉(zhuǎn)染到骨肉瘤細(xì)胞株F5M2中,Western-blot和quantitative RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果顯示LEF-1在骨肉瘤細(xì)胞株F5M2中的表達(dá)下調(diào)。
　　4.MTT實驗結(jié)果顯示,LEF-1siRNA實驗組F5M2細(xì)胞的增殖能力與陰性對照組和空白對照組相比顯著降低。Transwell實驗結(jié)果顯示,LEF-1siRNA實驗組F5M2細(xì)胞的侵襲和遷移能力與陰性對照組和空白對照組相比顯著降低。
　　結(jié)論