核仁素的表達(dá)在骨肉瘤細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、第一部分核仁素和bc1-2在骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)
　　目的：
　　選擇p53野生型人骨肉瘤細(xì)胞株U-2 OS、p53變異型人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63和p53缺失型人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2,并選擇永生化人成骨細(xì)胞hFOB1.19(人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞)作為正常對(duì)照,定性了解上述細(xì)胞正常情況下核仁素和bcl-2的表達(dá)情況,并利用MTT實(shí)驗(yàn)研究順鉑對(duì)上述骨肉瘤細(xì)胞株的增值抑制作用。
　　方法：
　　取指數(shù)生長(zhǎng)期的U-

2、2 OS、MG-63、Saos-2和hFOB1.19,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,分別設(shè)計(jì)針對(duì)核仁素、bc1-2和內(nèi)參GAPDH的PCR引物,進(jìn)行PCR檢測(cè)核仁素和bc1-2在人成骨肉瘤中的基因表達(dá);分別提取細(xì)胞總蛋白,胞蛋白,利用免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)細(xì)胞中核仁素和bc1-2蛋白表達(dá)水平;利用MTT,檢測(cè)順鉑對(duì)不同P53功能狀態(tài)的骨肉瘤細(xì)胞凋亡抑制作用。
　　結(jié)果：
　　免疫印跡法(Wes

3、tern blotting)和RT-PCR結(jié)果顯示,在骨肉瘤細(xì)胞株U-2 OS、MG-63、Saos-2和正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19中,均檢測(cè)到了核仁素和bc1-2基因和蛋白的表達(dá)。與正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19相比較,U-2 OS、MG-63和Saos-2的核仁素和bc1-2基因和蛋白表達(dá)水平均顯著增高。
　　順鉑對(duì)不同骨肉瘤細(xì)胞株均有明顯的抑制作用,并且可能和核仁素的表達(dá)水平相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　不同P53

4、突變狀態(tài)的骨肉瘤細(xì)胞系與成骨細(xì)胞比較,核仁素過(guò)表達(dá)的同時(shí)伴隨bc1-2過(guò)表達(dá)。順鉑對(duì)不同骨肉瘤細(xì)胞株增值抑制作用可能與核仁素的表達(dá)水平相關(guān)。既初步驗(yàn)證了我們?cè)囼?yàn)條件的可行性,又為進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ):我們可以進(jìn)一步研究P53不同功能狀態(tài)下,使用反義核仁素寡核苷酸對(duì)順鉑誘導(dǎo)的化療敏感性的影響及進(jìn)一步用RNA-CHIP等實(shí)驗(yàn)研究核仁素和bc1-2之間的相互作用,為進(jìn)一步研究核仁素在骨肉瘤凋亡中的作用打下基礎(chǔ)。
　　第二部分反義核仁素

5、寡核苷酸以P53非依賴(lài)機(jī)制增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞順鉑化療敏感性
　　目的：
　　觀察核仁素反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對(duì)順鉑誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞株化療敏感性影響。
　　方法：
　　設(shè)計(jì)合成核仁素反義與隨機(jī)寡核苷酸并轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2、U2-OS和MG63,利用細(xì)胞免疫組化和Western Blot檢測(cè)核仁素反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染有效性;將每種骨肉瘤細(xì)胞分別隨機(jī)分為六組:空白對(duì)照組、單純用順鉑組、轉(zhuǎn)染隨機(jī)核仁素寡核苷酸組、轉(zhuǎn)染隨機(jī)核

6、仁素寡核苷酸后再用順鉑組、轉(zhuǎn)染反義核仁素寡核苷酸組和轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸后再用順鉑組;用MTT法分別檢測(cè)各組骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制率,并用Western Blot和RT-PCR檢測(cè)各組核仁素和Bc1-2蛋白及其mRNA表達(dá)的表達(dá)情況;用Hoechst33258染色方法檢測(cè)各組骨肉瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變及凋亡率;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組骨肉瘤細(xì)胞凋亡率;通過(guò)檢測(cè)各組骨肉瘤細(xì)胞caspase-3活性進(jìn)一步反映骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：

7、>　　細(xì)胞免疫組化和Western Blot檢測(cè)顯示核仁素反義寡核苷酸有效地下調(diào)核仁素、bc1-2基因和蛋白表達(dá);MTT、Westem Blot、RT-PCR、Hoechst33258染色、流式細(xì)胞術(shù)和caspase-3活性檢測(cè)顯示反義核仁素寡核苷酸有效地促進(jìn)了順鉑誘導(dǎo)的各種P53功能狀態(tài)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　反義核仁素寡核苷酸以P53非依賴(lài)機(jī)制增強(qiáng)人骨肉瘤細(xì)胞順鉑化療敏感性。
　　第三部分骨肉瘤細(xì)胞核仁

8、素過(guò)表達(dá)增加be1-2 mRNA穩(wěn)定性
　　目的：
　　了解骨肉瘤細(xì)胞株中核仁素過(guò)表達(dá)與bc1-2 mRNA穩(wěn)定性之間的關(guān)系。
　　方法：
　　結(jié)合放線菌素d研究不同骨肉瘤細(xì)胞株中bc1-2 mRNA穩(wěn)定性差別;利用RNA-CHIP技術(shù)研究不同骨肉瘤細(xì)胞株中核仁素與bc1-2mRNA的結(jié)合作用;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),研究反義下調(diào)核仁素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞bc1-2 mRNA穩(wěn)定性及核仁素與bc1-2 mRNA的結(jié)合作用的影