miR-494對胰腺癌生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　檢測miR-494在胰腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá),分析miR-494異常表達(dá)與胰腺癌臨床病理特性的臨床相關(guān)性;以胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1,PANC-1為研究對象,證實(shí)miR-494對胰腺癌細(xì)胞增殖,周期,凋亡,侵襲轉(zhuǎn)移,化療敏感性等生物學(xué)特性的影響;進(jìn)行miR-494與c-Myc和SIRT1相關(guān)性分析,明確miR-494靶向調(diào)控c-Myc和SIRT1;應(yīng)用小片段干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制c-Myc與SIRT1基

2、因表達(dá),通過研究小片段干擾后PANC-1細(xì)胞增殖,周期,凋亡,侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響,進(jìn)一步明確miR-494的作用機(jī)制是通過調(diào)控c-Myc和SIRT1實(shí)現(xiàn)。
　　研究方法:
　　實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測胰腺組(86例胰腺癌組織和41例正常胰腺組織)和胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1,Bxpc-3,PANC-1,SW1990,Miapaca-2)中miR-494的表達(dá),分析miR-494的表達(dá)與胰腺癌臨床

3、病理學(xué)特征及其預(yù)后的相關(guān)性;以胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和PANC-1為研究對象,分別轉(zhuǎn)染miR-494類似物(miR-494mimics)和抑制劑(miR-494inhibitor),實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-494的表達(dá),以確定轉(zhuǎn)染效果;MTT(二苯基溴化四氮唑藍(lán))和平板克隆觀察上調(diào)miR-494后對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響;蛋白免疫印跡(westernblot)檢測上調(diào)miR-494后細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因P21,CyclinD1

4、,BAX,Bcl-2,P53蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化和凋亡的變化;β-半乳糖苷酶染色(β-Galactosidasestaining,β-Gal)測定細(xì)胞衰老;Transwell檢測各組細(xì)胞遷移(Migration)和侵襲(Invasion)的影響,并用westernblot檢測遷移和侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)變化;采用MTT法檢測AsPC-1和PANC-1細(xì)胞經(jīng)上

5、調(diào)miR-494后對5-氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他濱(Gemcitabine,GEM)化療敏感性的變化;免疫組織化學(xué)染色法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測c-Myc和SIRT1在胰腺癌組織中的表達(dá),用Graphpad軟件對miR-494與c-Myc和SIRT1基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析;westernblot檢測轉(zhuǎn)染miR-494mimics和miR-494inhibitor后c-Myc和SIRT1蛋白水平的變換,并對miR-494同c-Myc和SI

6、RT1蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析;利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件(miRanda,miRDBandTargetScan)尋找miR-494與c-Myc和SIRT1的3'-非編碼區(qū)結(jié)合(3'-UTR)結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建c-Myc和SIRT1雙熒光報(bào)告基因質(zhì)粒,通過雙熒光報(bào)告初步證實(shí)miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1;為了進(jìn)一步明確miR-494的作用機(jī)制,以PANC-1為研究對象,小片段干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制c-Myc為siRNA-c

7、-Myc,小片段干擾RNA(siRNA)同時(shí)抑制c-Myc與SIRT1為siRNA-c-Myc+siRNA-SIRT1(co-transfected,共轉(zhuǎn)染組),對照為siRNA-NC(normalcontrol),westernblot檢測轉(zhuǎn)染后c-Myc和SIRT1蛋白的變化,以確定轉(zhuǎn)染效果;MTT(二苯基溴化四氮唑藍(lán))觀察各組對PANC-1細(xì)胞增殖的影響;蛋白免疫印跡(westernblot)檢測處理后細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因P21

8、,CyclinD1,BAX,Bcl-2,P53蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化和凋亡的變化;β-半乳糖苷酶染色(β-Galactosidasestaining,β-Gal)測定細(xì)胞衰老;Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲(Invasion)的影響;BALB/c裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定上調(diào)miR-494和干擾c-Myc后PANC-1細(xì)胞的成瘤能力,westernblot檢測瘤體c-Myc和SIRT1的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

9、　　miR-494在胰腺癌組織的表達(dá)水平明顯低于正常胰腺組織(0.567±0.049vs1.000±0.104,P<0.001);同正常組織相比,miR-494在胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1,Bxpc-3,PANC-1和SW1990中顯著下降,在AsPC-1(0.171±0.023vs1.060±0.131,p=0.0026)和PANC-1細(xì)胞(0.270±0.024vs1.060±0.131,p=0.004)中下降最為明顯;miR-494

10、高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯長于miR-494低表達(dá)患者(P=0.0366)。miR-494表達(dá)水平與胰腺癌患者年齡(p=0.0438)、腫瘤大小(p=0.0041)、TNM分期(p=0.0003)、淋巴侵襲(p=0.0010)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(p=0.0362)密切相關(guān),而與腫瘤組織分化程度、患者性別、腫瘤部位、血管浸潤、神經(jīng)侵犯無相關(guān)性(p>0.05)。由于胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和PANC-1的miR-494表達(dá)水平下降最為明顯,因此選取A

11、sPC-1和PANC-1作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染miR-494mimics后,miR-494表顯著上調(diào)(P<0.01),轉(zhuǎn)染miR-494inhibitor后miR-494下調(diào)(P<0.05),證實(shí)轉(zhuǎn)染有效。同各自的對照相比,轉(zhuǎn)染miR-494mimics后AsPC-1(45.13±5.38％,P<0.01)和PANC-1(41.42±3.95%,P<0.01)細(xì)胞增殖受到顯著抑制,轉(zhuǎn)染miR-494inhibitor后AsPC-1(23.

12、15±2.18%,P<0.05)和PANC-1(16.59±3.23%,P<0.05)細(xì)胞增殖增強(qiáng)。平板克隆結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-494mimics后AsPC-1和PANC-1克隆數(shù)顯著降低。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示上調(diào)miR-494后,同各自對照相比,AsPC-1(12.3±0.5%vs19.5±0.6%,P<0.05)和PANC-1細(xì)胞(8.9±0.8%vs17.1±0.3%,P<0.05)細(xì)胞凋亡增強(qiáng),AsPC-1(63.3±3.1%

13、vs73.7±2.5%,P<0.05)和PANC-1細(xì)胞(40.5.6±4.2%vs58.6±3.7%,P<0.01)細(xì)胞周期G1期細(xì)胞比率顯著增加。同各自對照相比,上調(diào)miR-494后AsPC-1(17.5±2.1%vs40.7±1.7%,P<0.01)和PANC-1細(xì)胞(14.6±3.3%vs60.9±3.8%,P<0.01)衰老顯著增加。Westernblot檢測顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-494mimics后Bcl-2和CyclinD1顯

14、著下調(diào),乙?；痯53、BAX和p21顯著上調(diào)。Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲和遷移能力發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-494后,AsPC-1和PANC-1細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著減弱,侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9顯著下降。藥敏結(jié)果顯示,同各自的對照相比,在轉(zhuǎn)染miR-494后,AsPC-1細(xì)胞對5-FU(7.93±1.05vs27.56±2.89ug/mL,P<0.01)和GEM(17.5±1.39vs82.56±4.27ug/mL,P<0.

15、01)IC50值顯著下降,PANC-1細(xì)胞對5-FU(9.41±1.63vs42.62±3.16ug/mL,P<0.01)和GEM(25.33±1.75vs63.25±5.36ug/mL,P<0.01)的IC50也顯著下降,即上調(diào)miR-494后,AsPC-1和PANC-1對5-Fu和GEM的藥物敏感性明顯增強(qiáng)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,胰腺癌組織中c-Myc(52.74±1.534%vs26.49±1.56%,P<0.001)和SIRT1

16、(48.35±1.51%vs20.51±1.34%,P<0.001)陽性細(xì)胞數(shù)比率明顯高于正常組織。實(shí)時(shí)定量PCR顯示,同正常組織相比,胰腺癌組織中c-Myc(1.379±0.086vs0.940±0.070,P=0.0017)和SIRT1(1.583±0.0.110vs1.044±0.092,P=0.0022)基因高表達(dá)。胰腺組織中miR-494同c-Myc(r=-0.6799,P<0.001)和SIRT1(r=-0.5293,P<0

17、.001)基因表達(dá)負(fù)相關(guān),提示miR-494可能調(diào)控c-Myc和SIRT1。生物信息學(xué)預(yù)測軟件(miRanda,miRDBandTargetScan)顯示,miR-494與c-Myc和SIRT1的3'-UTR有共同的結(jié)合位點(diǎn),提示miR-494可能靶向c-Myc和SIRT1。轉(zhuǎn)染miR-494mimics后c-Myc和SIRT1基因和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào),轉(zhuǎn)染miR-494inhibitor后c-Myc和SIRT1基因和蛋白表達(dá)均上調(diào)。對

18、miR-494同c-Myc和SIRT1基因表達(dá)的相關(guān)性分析提示:miR-494同c-Myc(r=-0.6374,P=0.0142)和SIRT1(r=-0.5973,P=0.0239)負(fù)相關(guān)。miR-494mimics與包含野生型c-Myc或SIRT1的3'-UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的熒光活性明顯低于對照組,證實(shí)miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1。轉(zhuǎn)染c-Myc干擾小片段后,c-Myc和SIRT1顯著下降(P<0.01),細(xì)胞增殖受抑制

19、,細(xì)胞G1期阻滯,細(xì)胞衰老增強(qiáng),侵襲能力減弱(P<0.05)。然而siRNA-c-Myc組對細(xì)胞凋亡無明顯影響(P>0.05)。提示miR-494的作用不單純依賴c-Myc。共轉(zhuǎn)染c-Myc和SIRT1干擾小片段后,同單獨(dú)干擾c-Myc組相比,對增殖和侵襲抑制以及周期阻滯更為明顯(P<0.01)。另外,共轉(zhuǎn)染組組PANC-1細(xì)胞凋亡率增加(12.65±0.55%vs.16.85±0.75%,P=0.0457),凋亡和周期相關(guān)蛋白的結(jié)果同

20、上調(diào)miR-494結(jié)果一致。提示miR-494的作用是通過同時(shí)靶向c-Myc和SIRT1實(shí)現(xiàn)。BALB/c裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)miR-494后PANC-1細(xì)胞的成瘤能力下降(0.83±0.18vs0.32±0.07g,P<0.05)。Westernblot檢測瘤體c-Myc和SIRT1的表達(dá)下調(diào)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.miR-494在胰腺癌組織中和胰腺癌細(xì)胞系的低表達(dá),低表達(dá)miR-494與患者年齡,腫瘤大小,胰腺癌

21、侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān),檢測miR-494的表達(dá)有助于判斷胰腺癌惡性程度及預(yù)后。
　　2.上調(diào)miR-494在胰腺癌細(xì)胞AsPC-1和PANC-1細(xì)胞中的表達(dá),可顯著抑制細(xì)胞增殖,增加凋亡和衰老細(xì)胞比例,發(fā)生G1期阻滯,減弱細(xì)胞侵襲和遷移能力,增強(qiáng)細(xì)胞對5-Fu和GEM的藥物敏感性。提示miR-494可能作為胰腺癌基因治療靶點(diǎn)。
　　3.c-Myc和SIRT1在胰腺癌組織中高表達(dá),并與miR-494負(fù)相關(guān)。在PANC-1細(xì)

22、胞中,上調(diào)miR-494后,c-Myc和SIRT1表達(dá)下調(diào);下調(diào)miR-494后,c-Myc和SIRT1上調(diào);miR-494與c-Myc和SIRT1負(fù)相關(guān)。結(jié)合雙熒光結(jié)果,證實(shí)miR-494直接靶向c-Myc和SIRT1。
　　4.同時(shí)下調(diào)c-Myc和SIRT1在PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)后,生物學(xué)效應(yīng)及效應(yīng)蛋白表達(dá)改變同上調(diào)miR-494一致;單一下調(diào)c-Myc后,凋亡未見明顯改變,且對細(xì)胞增殖抑制和周期阻滯較下調(diào)c-Myc和SI