阿帕替尼對胰腺癌惡性生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種高致死率的腫瘤，5年生存率小于5％且預(yù)后不良，主要和診斷的時候已屬晚期、早期以及進展性的侵襲和轉(zhuǎn)移、缺乏有效的治療手段相關(guān)。文獻報道，大約50％的胰腺癌患者被確診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來，雖然胰腺癌的治療手段發(fā)展迅速，但是死亡率仍然居高不下。雖然吉西他濱是胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但是并不能明顯延長患者的生存期，因此我們需要探索新的治療方法和分子靶向藥物以改善胰腺癌患者的預(yù)后。
　　血

2、管形成在很多腫瘤中已經(jīng)通過VEGF信號通路抑制劑被證實是一個很有前景的治療靶點。眾所周知，胰腺癌是一個乏血供的腫瘤。前期的VEGF信號通路抑制劑如貝伐單抗、Axitinib、Sorafenib等在胰腺癌的Ⅱ/Ⅲ期的臨床實驗中雖有一定的療效，但是結(jié)果不甚理想，目前零星的臨床研究個案報道提示阿帕替尼對晚期胰腺癌患者具有良好的療效。我們知道阿帕替尼是靶向血管生成的小分子TKI抑制劑，高度選擇性抑制VEGFR2，和Sorafenib等TKI抑制

3、劑相比主要競爭VEGFR2胞內(nèi)的ATP結(jié)合位點，具有良好的抑制腫瘤血管形成和抗腫瘤活性。研究顯示在很多人類腫瘤移植模型中單獨給予阿帕替尼或者聯(lián)合化療藥物，阿帕替尼具有良好的抗腫瘤活性，且耐受性良好、無明顯毒性作用。此外，阿帕替尼也在多種腫瘤細(xì)胞如胃癌細(xì)胞、膽管癌細(xì)胞等中展開體外研究，結(jié)果顯示阿帕替尼能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移并能促進凋亡等。但是目前尚未見對胰腺癌的研究報道，基于上述所述，本課題主要以胰腺癌BXPC-3、ASPC-1、

4、PANC-1胰腺癌細(xì)胞為研究對象，通過體內(nèi)體外研究，探討阿帕替尼對胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并尋找可能的相關(guān)機制，為研究阿帕替尼的臨床應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　通過體內(nèi)體外實驗探討阿帕替尼對胰腺癌惡性生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機制。
　　研究方法：
　　1、體外培養(yǎng)人BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌細(xì)胞，用不同藥物濃度的阿帕替尼（20、40μmol/L）抑制VEGF-VEGFR2通

5、路后，采用CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力，繪制生長曲線;通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測阿帕替尼對胰腺癌細(xì)胞生長周期分布的影響;采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化;通過劃痕和transwell腫瘤侵襲實驗觀察阿帕替尼對胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響;通過ELISA檢測自分泌的VEGF蛋白經(jīng)VEGF通路抑制劑阿帕替尼處理后，表達(dá)量是否發(fā)生改變。
　　2、體外培養(yǎng)人BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌細(xì)胞，用不同藥物濃度的阿帕替尼（20、4

6、0μmol/L）干預(yù)24小時后，通過Western-blot技術(shù)檢測BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌細(xì)胞中VEGFR2/PI3K/AKT通路的磷酸化改變及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量變化。
　　3、體外培養(yǎng)人BXPC-3胰腺癌細(xì)胞，將100ul細(xì)胞和PBS的混合液（含1×107細(xì)胞）接種于雄性、6周齡的BALB/C裸鼠的右腋下。當(dāng)可觸及腫塊時（約0.5cm左右），隨機分為對照組和阿帕替尼組，每組8只，通過灌胃給予阿帕

7、替尼(200mg/kg/d)以及安慰劑。然后每三天測一次腫瘤的長和寬以及裸鼠的體重。給藥3周后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進行稱重。將取下的腫瘤組織免疫組化，檢測兩組組織中CD31、Ki67表達(dá)情況，另外通過Tunel法檢測兩組的凋亡情況。
　　實驗結(jié)果：
　　1、體外培養(yǎng)的人BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度的阿帕替尼處理后，和對照組相比，三株細(xì)胞的生長明顯被抑制。細(xì)胞周期結(jié)果顯示在ASPC-1和P

8、ANC-1細(xì)胞中，低濃度的阿帕替尼引起S期和G2/M期的減少，使細(xì)胞增殖減慢，而高濃度的阿帕替尼主要引起G2/M期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖，在BXPC-3細(xì)胞中，低、高濃度的阿帕替尼主要引起G2/M期阻滯，細(xì)胞增殖被抑制。采用阿帕替尼體外干預(yù)24小時，阿帕替尼對BXPC-3和ASPC-1胰腺癌細(xì)胞具有促凋亡作用，但對PANC-1細(xì)胞沒有明顯影響。另外，阿帕替尼也可以抑制BXPC-3和ASPC-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而在PANC-1中，實

9、驗組和對照組相比沒有明顯改變。由于阿帕替尼阻斷VEGF/VEGFR2，使自分泌的VEGF的含量也明顯減少，且阿帕替尼濃度越高，分泌量越少。
　　2、Western-blot發(fā)現(xiàn)經(jīng)阿帕替尼處理后，各組細(xì)胞的VEGFR2的磷酸化水平減少，同時下游通路PI3K/AKT的磷酸化也明顯減少。VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與阿帕替尼對胰腺癌生物學(xué)行為的影響。另外在BXPC-3細(xì)胞中抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)量明顯下

10、調(diào)，且呈濃度依賴性，但在ASPC-1和PANC-1細(xì)胞未見明顯改變。
　　3、體內(nèi)實驗顯示阿帕替尼能明顯延緩胰腺癌移植瘤的生長。和對照組相比，阿帕替尼組的CD31的表達(dá)和Ki67陽性細(xì)胞的比例明顯降低，說明阿帕替尼可以減少血管密度以及癌細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　體內(nèi)體外研究結(jié)果顯示:阿帕替尼對胰腺癌具有抑制作用，能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡，且具有濃度依賴性，可能和減少VEGF/VEGFR2