靶向survivin的siRNA對(duì)膀胱癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的： 1、研究靶向survivin的小分子干擾RNA(siRNA)阻斷膀胱癌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的效應(yīng)，并探討survivin基因抗凋亡機(jī)制。 2、探討轉(zhuǎn)染靶向survivin的siRNA對(duì)膀胱癌生物學(xué)行為的影響及潛在的治療作用。 3、構(gòu)建靶向survivin的siRNA真核表達(dá)載體。 方法： 1、設(shè)計(jì)、合成一對(duì)survivin編碼基因序列特異的小分子干擾RNA(siRNA)，用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染T24

2、膀胱癌細(xì)胞，分不同的濃度組(50-200 nmol/L)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)survivin基因和caspase3基因mRNA表達(dá)。 2、建立膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分4組，實(shí)驗(yàn)各組分別瘤內(nèi)注射生理鹽水、5μg tg siRNA、5μg siRNA、5μg MMC，通過(guò)測(cè)量治療前后腫瘤的體積和病理變化觀(guān)察不同劑量siRNA治療效果并與MMC比較并分析處理后裸鼠外

3、周血肝腎功能變化。 3、設(shè)計(jì)合成靶向survivin的siRNA相應(yīng)DNA模板單鏈，將其克隆入空質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo，模板鏈兩端分別設(shè)計(jì)兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，退火形成siRNA載體插入片段。用限制性酶切將空載體線(xiàn)性化，T4DNA連接酶將siRNA片段插入空載體中，對(duì)該重組表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，獲得RNA干擾質(zhì)粒載體pRNAT-U6.1/Neo-survivin。 結(jié)果： 1、survivin編碼基因序列特異

4、性siRNA能有效下調(diào)survivin基因表達(dá)水平，并呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性，最大效應(yīng)濃度為100nmol/L，此時(shí)與對(duì)照相比survivin表達(dá)水平下調(diào)75.91％，并顯著的抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率達(dá)55.29％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，caspase3 mRNA表達(dá)水平明顯上升達(dá)239.80％，細(xì)胞凋亡率亦增加至45.70％，與對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2、在建立的膀胱癌T24細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模

5、型中，采用不同的處理后，腫瘤的生長(zhǎng)率各不相同。50μg MMC處理組和50μgsiRNA處理組與對(duì)照組相比差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，50μg MMC處理組和50μgsiRNA處理組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.548)，5μgsiRNA處理組與對(duì)照組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.486)。 3、PCR、酶切鑒定、DNA測(cè)序驗(yàn)證了表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，無(wú)堿基突變。 結(jié)論： 1、siRNA-survivin能顯

6、著下調(diào)膀胱癌細(xì)胞survivin基因表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可能成為膀胱癌基因治療的新工具。 2、survivin基因可能是通過(guò)下調(diào)caspase3表達(dá)來(lái)抑制凋亡。 3、成功構(gòu)建了靶向survivin基因表達(dá)的RNA干擾質(zhì)粒載體pRNAT-U6.1/Neo-survivin。 4、通過(guò)構(gòu)建載體導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的siRNA與化學(xué)合成的siRNA作用一致，且其轉(zhuǎn)染率高，作用時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用低，