siRNA干擾TGFBR3對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景與目的：
　　背景：研究表明TGFBR3在人類(lèi)多種腫瘤中表達(dá)異常，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。本課題組前期研究顯示：在膀胱癌組織中，TGFBR3表達(dá)異常，可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但其在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌生物學(xué)行為的影響還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)及siRNA干擾TGFBR3在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而研究其對(duì)膀胱癌生物學(xué)行為的影響。
　　方法：利用qRT-PCR及Western Bl

2、otting檢測(cè)正常膀胱上皮細(xì)胞株SV-HUC-1、膀胱癌細(xì)胞株5637及T24中TGFBR3的表達(dá)，篩選出高表達(dá)TGFBR3的細(xì)胞株。使用化學(xué)合成的siRNA干擾高表達(dá)TGFBR3的細(xì)胞株，并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)觀察TGFBR3對(duì)膀胱癌生物學(xué)行為的影響。設(shè)計(jì)并合成四對(duì)特異性干擾TGFBR3的siRNA，利用qRT-PCR篩選出可以有效干擾TGFBR3 mRNA達(dá)75%以上的序列，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究干

3、擾TGFBR3后膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)及活性的變化，選擇PI染色法研究干擾TGFBR3后膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞周期分布的變化，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)研究干擾TGFBR3后膀胱癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移、侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：本組PCR及Western Blotting實(shí)驗(yàn)：無(wú)論在mRNA水平還是在蛋白水平，TGFBR3在三株細(xì)胞中的表達(dá)為：T24最高，SV-HUC-1其次，5637最低。三者mRNA表達(dá)量分別為3.420±0.

4、0875、1.000±0.1800、0.620±0.1270(P＜0.05)。因此選用T24細(xì)胞作為后續(xù)RNAi的工具細(xì)胞。設(shè)計(jì)合成的四對(duì)siRNA-R3-1-4均可以降低T24細(xì)胞TGFBR3的表達(dá)，干擾效率分別為：85.48%、89.37%、79.83%、68.78%(P＜0.001)。因此選擇siRNA-R3-1-3用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。WST-1結(jié)果顯示：與Mock組、siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染后48h時(shí)，siRNA-TGFBR3組細(xì)

5、胞的生長(zhǎng)及活性降低（P＜0.01），72h時(shí)兩者差異進(jìn)一步增大（P＜0.001）。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Mock組、siRNA-NC組相比，siRNA-TGFBR3組克隆形成數(shù)明顯減少（P＜0.05）。碘化丙啶染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：siRNA-TGFBR3組與siRNA-NC組細(xì)胞周期分布相似，未見(jiàn)明顯sub-G1峰。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：siRNA-TGFBR3組較siRNA-NC組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱。進(jìn)一步的Transwell遷移侵襲實(shí)

6、驗(yàn)顯示：siRNA-NC、siRNA-TGFBR3兩組遷移到下室的每視野細(xì)胞數(shù)分別為258.0±12.5個(gè)、62.7±6.0個(gè)（P＜0.001），siRNA-NC、siRNA-TGFBR3兩組侵襲到下室的每視野細(xì)胞數(shù)分別為158.4±20.8個(gè)、20.3±8.5個(gè)（P＜0.001）。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)明確顯示TGFBR3在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，TGFBR3在5637細(xì)胞中表達(dá)較SV-HUC-1低，而在T24細(xì)胞