hepaCAM基因在膀胱癌中表達(dá)及對T24細(xì)胞生物學(xué)影響.pdf

1、第一部分 目的：探討hepaCAM基因在膀胱移行細(xì)胞癌(transitionalcellcarcinoma of the bladder，TCCB)中的表達(dá)及臨床意義。 方法：采用RT-PCR方法檢測28例正常膀胱對照和34例膀胱移行細(xì)胞癌中hepaCAM基因mRNA的表達(dá)；分析其與膀胱腫瘤臨床參數(shù)特征間的關(guān)系。 結(jié)果：hepaCAM基因在TCCB中表達(dá)明顯低與正常膀胱對照組(p＜0.01)，且與TCCB分級有關(guān)

2、(p＜0.05)，與臨床分期、性別、年齡及復(fù)發(fā)無關(guān)(P＞0.05)。 結(jié)論：hepaCAM基因在TCCB中表達(dá)降低或缺失，與膀胱癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是檢測膀胱移行細(xì)胞癌一種新的輔助診斷指標(biāo)。 第二部分 目的：野生型及缺失細(xì)胞外結(jié)構(gòu)突變體hepaCAM基因真核表達(dá)載體pEGFP-N2-hepaCAM及pEGFP-N2-hepaCAM-mt的鑒定，觀察轉(zhuǎn)染后野生型及突變hepaCAM蛋白在T24細(xì)胞中定位，獲得篩選穩(wěn)

3、定表達(dá)野生型及突變體蛋白的T24細(xì)胞的實驗方法。 方法：野生型及缺失細(xì)胞外結(jié)構(gòu)突變體hepaCAM基因的重組真核表達(dá)載體pEGFP-N2-hepaCAM及pEGFP-N2-hepaCAM-mt經(jīng)Hind III和Barn H I雙酶切及序列鑒定，轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株，熒光顯微鏡計算脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率，激光共聚焦顯微鏡觀察hepaCAM蛋白及突變體hepaCAM-mt蛋白在T24細(xì)胞的定位。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的

4、細(xì)胞，Westem blot檢測蛋白表達(dá)。 結(jié)果：獲得含有野生型hepaCAM及突變體hepaCAM-mt的真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定、高效轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞的方法。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染時間為48h，最適合脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例為2:1。激光共聚焦顯示：單個廣泛延展細(xì)胞上，hepaCAM蛋白主要定位于核周區(qū)域及細(xì)胞突起表面；當(dāng)細(xì)胞相互連接時，hepaCAM蛋白形成并指結(jié)構(gòu)顯著分布在細(xì)胞膜表面相互接觸的突起上，呈現(xiàn)典型細(xì)胞粘附分子

5、特性。當(dāng)細(xì)胞外區(qū)域缺失時，突變體hepaCAM-mt蛋白定位發(fā)生了明顯改變：在單個細(xì)胞中主要集中在細(xì)胞核周區(qū)域；細(xì)胞相互連接時，蛋白非特異性的分布于整個細(xì)胞中，而并非集中在細(xì)胞相互連接區(qū)域。篩選出穩(wěn)定表達(dá)野生型hepaCAM及其突變體蛋白的T24細(xì)胞，可以分別有效的表達(dá)hepaCAM蛋白及hepaCAM-mt蛋白。檢測到hepaCAM蛋白量約為75kDa，而hepaCAM-mt蛋白分子量約為50kDa。 結(jié)論：重組真核表達(dá)載體能

6、夠有效的轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，從而表達(dá)野生型hepaCAM蛋白及突變體hepaCAM-mt蛋白，為下一步研究hepaCAM基因在TCCB中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。 第三部分 目的：探討hepaCAM及突變體hepaCAM-mt基因?qū)24細(xì)胞粘附力、活動力及增殖力影響。 方法：通過真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有野生型hepaCAM及突變體hepaCAM-mt的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞后，采用細(xì)胞粘

7、附實驗、細(xì)胞解離實驗探討hepaCAM基因及突變體對T24細(xì)胞粘附力的影響；通過基質(zhì)膠遷移實驗、傷口愈合實驗對T24細(xì)胞的活動力進(jìn)行探討；通過細(xì)胞增殖實驗對轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞的增殖力進(jìn)行研究，從而對hepaCAM及其突變體基因?qū)24細(xì)胞的生物學(xué)影響進(jìn)行探討。 結(jié)果：穩(wěn)定表達(dá)野生型hepaCAM蛋白的T24細(xì)胞與表達(dá)突變體蛋白的細(xì)胞及陰性對照組相比，表現(xiàn)出明顯粘附力及活動力增強(p＜0.01)，并且具有明顯抑制T24細(xì)胞增殖的能力