石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24的作用及機(jī)制初探.pdf

1、膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，原發(fā)病例中75％屬于淺表性膀胱癌(TIS、Ta或T1期)，浸潤(rùn)性膀胱癌占了原發(fā)病例中的25％（T2-T4期）。淺表性膀胱癌的治療手段，主要包括兩種方法預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)：腔內(nèi)切割手術(shù)治療，術(shù)后膀胱灌注化療。而目前浸潤(rùn)性膀胱癌的主要治療手段，選取的是膀胱根治性全切除術(shù)，聯(lián)合術(shù)后輔助化療。盡管膀胱癌的治療手段五花八門多種多樣，50％-70％的淺表性腫瘤患者中，依然出現(xiàn)復(fù)發(fā)和浸潤(rùn)性腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的難題。5年生存率的數(shù)據(jù)證

2、實(shí)，浸潤(rùn)性膀胱癌患者僅有14-30％。在臨床對(duì)膀胱癌的治療中，出現(xiàn)化療藥物的耐藥性，總體而言，膀胱癌的治療療效目前仍然難以令人滿意。所以，新的靶向藥物治療膀胱癌能否找到，并解決其治療膀胱癌的中出現(xiàn)耐藥性，這問題十分重要。
　　石蒜堿是一種芐基苯乙胺類生物堿，英文名為lycorine，分子量為287.313，可從我國(guó)傳統(tǒng)中藥--石蒜中分離得到，森島庫(kù)太（日本）在1937年最早分離出來。研究表明，石蒜堿類衍生物具有抗炎、抗寄生蟲、抗瘧

3、疾以及抗病毒作用。除此之外，還可抑制乙酰膽堿酯酶活性、心血管保護(hù)功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。最近還發(fā)現(xiàn)其有導(dǎo)致破骨細(xì)胞抑制生成的生物學(xué)作用。石蒜堿類衍生物在近年來，國(guó)內(nèi)外合成了多種。目前出現(xiàn)的有鹽酸石蒜堿，英文名為L(zhǎng)ycorine hydrochloride，氧化石蒜堿，英文名為L(zhǎng)ycobetaine，二氫石蒜堿，英文名為Dihydrolycorine，偽石蒜堿，英文名為Pseudolycorine等。雖然石蒜堿已經(jīng)在多種腫瘤中做了各種作用

4、及機(jī)制的研究，目前石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞，尚未有較系統(tǒng)的研究。
　　目的：
　　探討石蒜堿對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T24及移行上皮細(xì)胞SVHUC的作用，觀察石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞與移行上皮細(xì)胞的細(xì)胞抑制作用，探索石蒜堿可能的作用機(jī)制;為治療人膀胱癌尋找新的思路。
　　方法：
　　一、石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24及移行上皮細(xì)胞SVHUC生長(zhǎng)抑制作用的影響
　　1.1采用MTS法檢測(cè)石蒜堿對(duì)人膀胱癌細(xì)胞T24的生長(zhǎng)抑制率
　　

5、1.2hoechst33342檢測(cè)石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24及移行上皮細(xì)胞SVHUC凋亡細(xì)胞的比例
　　二、石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24作用機(jī)制初探
　　2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析凋亡相關(guān)通路基因轉(zhuǎn)錄水平的變化
　　2.2Western-blot分析凋亡相關(guān)通路蛋白的變化
　　2.3免疫熒光檢測(cè)石蒜堿對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞內(nèi)P-Akt和cleaved-caspase-3表達(dá)的影響
　　三、石蒜堿對(duì)人膀胱癌細(xì)

6、胞T24皮下成瘤能力的影響
　　結(jié)果：
　　1石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24生長(zhǎng)抑制作用的影響
　　1.1石蒜堿對(duì)T24細(xì)胞作用12h，24h，48h，72h的半數(shù)抑制濃度分別為46.9，14.7，7.5，and3.6uM。
　　1.2hoeehst33342測(cè)得細(xì)胞凋亡比例：T24實(shí)驗(yàn)組(46％)，T24對(duì)照組(1％)，SVHUC實(shí)驗(yàn)組(5％)，SVHUC對(duì)照組(3％)。
　　2石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24作用機(jī)制

7、初探
　　2.125uM石蒜堿處理T24細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bax基因表達(dá)下降，Bcl-2表達(dá)升高，Akt無顯著性改變。
　　2.2不同濃度石蒜堿處理T24細(xì)胞后，Western-blot結(jié)果顯示25μmol/L及50μmol/L的石蒜堿即能上調(diào)PTEN、cleaved-caspase-3表達(dá)，而下調(diào)P-Akt、caspase-3的表達(dá)。而Akt蛋白水平則變化不大。
　　2.3免疫熒光結(jié)果顯示：PBS作

8、用后，P-Akt Ser473在膀胱癌細(xì)胞T24中呈強(qiáng)熒光著色;而與DMSO組相比較，25μg/ml石蒜堿處理后，T24細(xì)胞內(nèi)熒光著色逐漸減弱。相反，cleaved-caspase-3在膀胱癌細(xì)胞T24中呈弱熒光著色;而與PBS組相比較，25μg/ml石蒜堿處理后，T24細(xì)胞內(nèi)熒光著色明顯增強(qiáng)。
　　3石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24皮下成瘤能力的影響
　　石蒜堿對(duì)前列腺癌細(xì)胞皮下成瘤能力的影響：與PBS對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組(5mg)

9、及實(shí)驗(yàn)組(10mg)均能顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)速度和腫瘤體積(p＜0.05)，而實(shí)驗(yàn)組(5mg)和實(shí)驗(yàn)組(10mg)注射組組間亦有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24有生長(zhǎng)抑制作用
　　2.石蒜堿對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24有凋亡誘導(dǎo)作用。
　　3.石蒜堿可能通過抑制P-Akt及相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24的抗腫瘤作用。
　　4.石蒜堿可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞T24的皮下成瘤能力