胰腺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性及增殖與分化調(diào)控的研究.pdf

1、第一部分、胰腺癌干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的：研究人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中腫瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定方法。 方法：將PANC-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以CD44和CD24作為細(xì)胞表面標(biāo)志。利用流式細(xì)胞儀，從該細(xì)胞株中分離出細(xì)胞亞群。通過裸鼠體內(nèi)接種成瘤實(shí)驗(yàn)，鑒定各亞群細(xì)胞體內(nèi)增殖能力；通過S-P法檢測(cè)成瘤組織和PANC-1細(xì)胞株中CD44和CD24的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)CD44和CD24 mRNA的表達(dá)。 結(jié)

2、果：PANC-1細(xì)胞系在培養(yǎng)液I中培養(yǎng)時(shí)，CD44+和CD24+的表達(dá)分別為5.1％～17.5％和21.8％～70.1％，表型為CD44+CD24+的胰腺癌細(xì)胞僅占0.9％～3.5％，而在培養(yǎng)液II中培養(yǎng)，CD44+和CD24+的表達(dá)分別為5.9％～16.8％和19.5％～74.6％，CD44+CD24+為0.8％～4.1％。在兩種培養(yǎng)基中，細(xì)胞各表型的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。裸鼠皮下植入5×103個(gè)CD44+CD24+亞群細(xì)胞，4周即可見明

3、顯的新生腫瘤塊(2/8)，而CD44-CD24-亞群，即使植入1×105個(gè)細(xì)胞，12周也難形成種植瘤。前者體外成瘤能力比后者至少?gòu)?qiáng)20～50倍（P<0.05或P<0.01）；所形成的腫瘤和PANC-1細(xì)胞系無組織學(xué)差異。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，同一培養(yǎng)基內(nèi)各組細(xì)胞均表達(dá)CD44和CD24mRNA，各組間CD44和CD24mRNA的表達(dá)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但不同培養(yǎng)基中，CD44和CD24mRNA的表達(dá)值差異性顯著(

4、P<0.01)。 結(jié)論：CD44和CD24可作為分選PANC-1中腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)志；分選出的CD44+CD24+亞群細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征。 第二部分、胰腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性。 目的：初步了解胰腺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性。 方法：采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖活性，利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，TRAP銀染法測(cè)定端粒酶活性。 結(jié)果：與CD44-CD24-亞群比較，CD44+CD24+亞群生長(zhǎng)緩慢

5、，第7天才出現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng)的趨勢(shì)，增殖能力較低，倍增時(shí)間更長(zhǎng)，前者第5天已出現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng)的趨勢(shì)。與對(duì)應(yīng)的亞群細(xì)胞相比，CD44+、CD24+和CD44+CD24+細(xì)胞，無論S期比例，還是（S+G2/M）期比例都較低（P<0.05或P<0.01）。具有干細(xì)胞特性的CD44+CD24+細(xì)胞端粒酶活性比對(duì)應(yīng)組要高得多。 結(jié)論：胰腺癌干細(xì)胞具有體外增殖能力較低，倍增時(shí)間較長(zhǎng)，端粒酶活性高，處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)等特性。 第三部分、Notch

6、1信號(hào)系統(tǒng)對(duì)胰腺癌干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。 目的：探討激活的Notch1信號(hào)系統(tǒng)對(duì)胰腺癌干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。 方法：向體外培養(yǎng)的胰腺癌干細(xì)胞中分別加入Notch1激活劑rhNF-κB和抑制劑γ-secretase inhibitor II(MW167)，空白對(duì)照加PBS緩沖液。RT-PCR、免疫印跡（Western blot）、流式細(xì)胞儀和免疫組化等方法檢測(cè)Notch1信號(hào)系統(tǒng)的表達(dá)。 結(jié)果：胰腺癌干細(xì)胞中有