印跡基因TSSC3對骨肉瘤生物學特性的影響及其機制研究.pdf

1、骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的一種高轉移性骨原發(fā)惡性腫瘤，肺轉移是最主要的死亡原因。骨肉瘤的轉移多發(fā)生于早期，85%～90%的患者就診時已存在臨床上不能發(fā)現的轉移灶。近年來的新輔助化療使得患者肺轉移率得到明顯控制，骨肉瘤患者的預后得到了很大的提高，5年生存率達到60%～80%。但骨肉瘤的長期生存率并沒有明顯提高，骨肉瘤的治療效果仍處于“瓶頸期”，骨肉瘤細胞對化療的敏感性差以及對化療藥物的耐藥是影響其化療療效的主要因素。因此，控制骨肉瘤的轉

2、移和克服化療耐藥對于提高骨肉瘤患者的生存率有重要意義。
　　 腫瘤的轉移包含了一系列的復雜事件。腫瘤細胞獲得“失巢凋亡抵抗”是其成功實現轉移的基礎和關鍵，而細胞周期阻滯和凋亡通路障礙也是化療耐藥產生的主要機制之一，因此探討骨肉瘤耐藥及失巢凋亡抵抗的機制將為深入闡明骨肉瘤轉移及耐藥提供有意義的理論和實驗依據。
　　 本課題組前期研究發(fā)現，印跡基因TSSC3參與了成骨細胞的惡性轉化。TSSC3是已報道的唯一與凋亡相關的印跡基

3、因。目前關于TSSC3與腫瘤的研究很少，僅在完全性葡萄胎、Wilms’腫瘤和惡性膠質瘤中有表達缺失的報道，其在骨肉瘤中的表達情況及其發(fā)揮的功能作用和分子機制尚缺乏相關研究。
　　 有鑒于此，本研究共分三部分。第一部分檢測了TSSC3在各骨肉瘤細胞系以及骨肉瘤組織中的表達，并進一步采用體內和體外實驗模型，研究TSSC3在骨肉瘤中所發(fā)揮的功能作用。第二部分探討了TSSC3對各凋亡通路關鍵分子表達變化的影響；并進一步探討了TSSC3對

4、骨肉瘤化療敏感性的影響及其分子機制。第三部分在第一、二部分對TSSC3在骨肉瘤中表達、功能及作用機制研究的基礎上，進一步探討TSSC3調控骨肉瘤失巢凋亡抵抗進而在骨肉瘤遷移、侵襲、轉移中發(fā)揮的作用及其分子機制。
　　 研究內容和主要結果結論如下：
　　 一、TSSC3在骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中普遍低表達，提示其表達可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關
　　 1.TSSC3在骨肉瘤細胞系中普遍低表達：
　　 采

5、用熒光定量PCR、RT-PCR和免疫熒光染色實驗方法得到如下結果：
　　 (1)TSSC3在惡性轉化的成骨細胞(MTF)中的表達明顯低于hFOB1.19成骨細胞，差異有統計學意義。
　　 (2)TSSC3在成骨細胞系中的表達均高于所有被檢測的骨肉瘤細胞系，其在低級別來源的骨肉瘤細胞系HOS和MG63中的表達要高于高級別來源的細胞系U2OS和SaOS2，且TSSC3主要定位于胞質。
　　 2.TSSC3在骨肉瘤組織

6、中普遍低表達：
　　 我們采用RT-PCR和卡方檢驗的統計學方法得到如下結果：
　　 (1)TSSC3在腫瘤組織(陽性率為45.8%，表達豐度為0.18±0.03)中的表達顯著低于配對癌旁組織(陽性率為79.1%，表達豐度為0.52±0.05)，差異有統計學意義。
　　 (2)TSSC3在骨肉瘤組織(54.2%)中的表達缺失率顯著高于配對癌旁組織(20.8%)，差異有統計學意義，但骨肉瘤組織中TSSC3的表達缺失

7、率與骨肉瘤患者的性別、年齡和病理組織學分型沒有顯著的相關性。
　　 二、TSSC3的表達抑制了骨肉瘤細胞的增殖
　　 1.采用GeneSwitch誘導表達系統成功構建了穩(wěn)定高表達TSSC3的SaOS2細胞系(overTSSC3)；采用pSilencer5.1 Retro表達系統成功構建了穩(wěn)定低表達TSSC3的SaOS2細胞系(siTSSC3)。
　　 2.TSSC3的表達抑制了骨肉瘤細胞的增殖：
　　 (

8、1)CCK8比色法顯示：overTSSC3細胞在接種2天后，增殖速率顯著低于對照組(SaOS2和overCON)；相反，siTSSC3細胞在接種5天后，增殖速率顯著高于對照組(SaOS2和siCON)，差異有統計學意義。
　　 (2)平板克隆形成實驗顯示：過表達TSSC3明顯地降低了大克隆形成率(從17.75±0.01%降低到0.67±0.01%)；相反，siTSSC3細胞的總克隆、大克隆、小克隆形成數均顯著高于對照組(SaOS

9、2和siCON)，特別是大克隆形成數從7±2升高到107±12，差異有統計學意義。
　　 (3)Ki67免疫熒光染色顯示：高表達TSSC3明顯地降低了Ki67的表達強度和陽性率；反之，低表達TSSC3則顯著地增強了Ki67的表達強度和陽性率，差異有統計學意義。
　　 (4)PI染色和流式細胞術進行細胞內DNA倍體分析顯示：高表達TSSC3使G0/G1期細胞比例顯著增加；反之，低表達TSSC3則使G0/G1期細胞比例顯著降

10、低。
　　 3.TSSC3的表達抑制了裸鼠體內骨肉瘤細胞的增殖：
　　 (1)免疫缺陷小鼠移植瘤實驗顯示：overTSSC3組成瘤率為18%，成瘤潛伏期為28天，接種7周后移植瘤體積為15.94±9.28(mm3±SD)；對照組SaOS2、overCON的成瘤率分別為86%和67%，成瘤潛伏期分別為14天和16天，接種7周后移植瘤體積分別為90.17±15.42(mm3±SD)和159.75±73.65(mm3±SD)，

11、差異有統計學意義。相反，siTSSC3組成瘤率為100%，成瘤潛伏期為6天，接種5周后移植瘤體積為153.45±42.38(mm3±SD)；siCON組成瘤率為67%，成瘤潛伏期為12天，接種5周后移植瘤體積為66.10±24.64(mm3±SD)，差異有統計學意義。結果表明TSSC3明顯地降低了骨肉瘤細胞體內的成瘤力。
　　 (2)HE染色觀察移植瘤組織形態(tài)，結果顯示：siTSSC3和SaOS2組來源的移植瘤，細胞大小不一，細

12、胞核深染且異形性大，可見部分病理性核分裂像，有較多的壞死灶和高密度的微血管；而在overTSSC3組來源的移植瘤組織中，沒有觀察到壞死組織、病理性核分裂像以及高密度的微血管。結果說明低表達TSSC3使移植瘤更加接近于骨肉瘤的組織學特征。
　　 (3)免疫組化染色檢測移植瘤組織中TSSC3、Ki67表達，結果顯示：overTSSC3組高表達TSSC3，SaOS2組弱表達TSSC3，siTSSC3組中未檢測到TSSC3的表達。采用K

13、i67染色，對瘤體內腫瘤細胞的增殖活性進行標記發(fā)現，overTSSC3組低表達Ki67，siTSSC3組高表達Ki67，差異有統計學意義。結果表明TSSC3在移植瘤組織中的表達與Ki67的表達負相關。
　　 三、TSSC3的表達通過線粒體途徑促進了骨肉瘤細胞的凋亡
　　 1.TSSC3的表達促進了骨肉瘤細胞的凋亡：
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察，對照組SaOS2、overCON細胞呈短梭形，折光性強，透明度大，輪

14、廓不清，胞質中未見顆粒樣物質；而overTSSC3細胞則生長緩慢，形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點，折光性降低，細胞間隙增大，胞質中出現顆粒樣物質，細胞活力差，并有較多懸浮細胞。透射電鏡下觀察，overTSSC3細胞較對照組顯示出了凋亡的特征，核膜不規(guī)則，核濃縮碎裂，出現新月體形核，胞質中出現空泡及凋亡小體。以上形態(tài)學的觀察結果提示了TSSC3對細胞凋亡有促進作用。
　　 (2)AnnexinV/PI染色，流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果

15、顯示：相對于對照組，overTSSC3組的早期凋亡和晚期凋亡率分別從5.70%和1.39%明顯地提高到了14.70%和9.97%。相反，低表達TSSC3使早期和晚期凋亡率分別下調了4.04倍和4.32倍。另外，我們采用PI染色檢測亞G0期細胞的比率，細胞的凋亡率隨著TSSC3的表達下調而下降。TUNEL染色的結果同樣顯示了在overTSSC3細胞中，FITC陽性細胞的表達要明顯地高于對照組。
　　 2.TSSC3的表達促進了瘤體

16、細胞的凋亡：移植瘤組織TSSC3和TUNEL免疫熒光雙染結果顯示：相對于對照組，overTSSC3細胞來源的移植瘤組織中TSSC3和TUNEL染色的比例和強度同時明顯地增加，且共定位于同一細胞中，結果表明持續(xù)的TSSC3表達明顯增加了瘤體細胞的凋亡。
　　 3.TSSC3通過線粒體凋亡信號轉導途徑誘導骨肉瘤細胞的凋亡：
　　 (1)熒光定量PCR結果顯示：高表達TSSC3明顯地增加了caspase-3和Cytc的表達，并

17、同時上調了Bax：Bcl-2的比率；對于死亡受體通路而言，TSSC3的上調反而引起了Fas的下調以及Flip的上調，差異有統計學意義。反之，相對于siCON細胞，在siTSSC3細胞中caspase-3，Cytc，Bax：Bcl-2和Flip分子明顯地下調，Fas則明顯地上調，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3在基因水平通過上調內源性線粒體通路發(fā)揮誘導凋亡的作用。
　　 (2)免疫熒光染色結果顯示：相對于overCON細胞，

18、overTSSC3細胞上調了cleavedcaspase-3的表達，同時下調procaspase-9和Bcl-2的表達。相反，相對于siCON細胞，procaspase-9和Bcl-2在siTSSC3細胞中表達增強，但是procaspase-8的表達在overTSSC3細胞和overCON細胞中沒有明顯的不同。Western Blot檢測結果顯示：高表達TSSC3明顯增加了cleaved caspase-3和Cytc蛋白的表達水平，同時

19、顯著下調了Fas蛋白的表達；而Cytc在siTSSC3細胞中的表達則明顯低于siCON細胞，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3在蛋白水平通過上調內源性線粒體通路發(fā)揮誘導凋亡的作用。
　　 (3)JC-1染色結果顯示：overCON細胞展示出桔紅色的熒光，代表正常細胞線粒體的JC-1聚合體，而在overTSSC3細胞中紅色熒光轉變?yōu)榫G色熒光，更加接近于陽性對照，代表凋亡細胞線粒體的JC-1單體。TSSC3使綠色/紅色熒光強度的

20、比值從0.90±0.04增加到4.31±0.87，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3破壞了線粒體膜電位，誘導了內源性凋亡信號轉導途徑。
　　 四、TSSC3通過誘導線粒體途徑的凋亡增加了骨肉瘤細胞對化療的敏感性
　　 1.TSSC3通過誘導凋亡增加了骨肉瘤細胞對化療的敏感性：
　　 (1)AnnexinV/PI染色，流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果顯示：順鉑和表柔比星處理后，overTSSC3細胞的凋亡率(特別

21、是晚期凋亡率)明顯地高于overCON細胞。而低表達TSSC3則明顯地降低了化療藥處理后細胞的凋亡。
　　 (2)TUNEL免疫熒光染色結果顯示：overTSSC3細胞在化療藥處理后FITC熒光強度明顯地高于對照細胞。
　　 2.TSSC3通過線粒體凋亡信號轉導途徑明顯地增加了骨肉瘤細胞對化療藥處理的敏感性：
　　 (1)免疫熒光染色結果顯示：化療藥處理后，cleaved caspase-3在overTSSC3細

22、胞表達強度顯著高于overCON細胞。Western Blot檢測結果顯示：Cytc、cleaved caspase-3以及cleaved PARP在overTSSC3細胞的表達水平顯著地高于對照細胞；相反，Cytc在siTSSC3細胞中的表達顯著低于siCON細胞，差異有統計學意義。
　　 (2)JC-1免疫熒光染色結果顯示：化療藥處理后，JC-1單體在overTSSC3細胞中的表達明顯地高于overCON細胞，高表達TSSC

23、3使綠色/紅色熒光強度的比值從1.33±0.67增加到6.73±1.65，差異有統計學意義。線粒體膜電位的破壞以及Cytc等凋亡分子在overTSSC3細胞中表達的增加，說明TSSC3通過線粒體途徑促進了化療藥引起的骨肉瘤細胞凋亡。
　　 五、TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強的過程中漸進性地表達下調
　　 1.成功建立了骨肉瘤細胞失巢凋亡抵抗模型：
　　 (1)懸浮-貼壁循環(huán)培養(yǎng)法建立骨肉瘤失巢凋亡抵抗細胞模型：

24、SaOS2懸浮3天后，貼壁培養(yǎng)直至長成單細胞層，再次懸浮14天后再次貼壁培養(yǎng)，所形成的單層細胞即為失巢凋亡抵抗細胞，記為SaOSar。懸浮培養(yǎng)后細胞變圓，最初為散在的單個細胞逐漸成團生長，隨著時間的推移細胞團塊不斷增大、致密。
　　 (2)骨肉瘤細胞失巢凋亡抵抗模型的鑒定：采用流式細胞術檢測失巢凋亡細胞模型中各時相點懸浮細胞的凋亡率，貼壁培養(yǎng)SaOS2細胞的凋亡率(僅指早期凋亡率)為4.34%，懸浮24h之內凋亡率上升得最快，達

25、到20.36%，3天和7天時分別為33.76%和49.36%，7天后凋亡率上升逐漸變緩，到14天時為55.28%，14天后凋亡率無顯著變化。SaOS2與SaOSar細胞懸浮24h后檢測凋亡率，前者的早期與晚期凋亡率分別為14.39%和21.79%，而后者僅為5.35%和10.07%。
　　 2.TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強的過程中漸進性地表達下調：
　　 采用熒光定量PCR、免疫熒光染色的實驗方法得到如下結果：

26、>　　 (1)TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強的過程中漸進性地表達下調。其中懸浮第1天和第7天下降幅度最顯著，都較其前一時間點下降了65%，懸浮第14天后TSSC3的表達與未懸浮的SaOS2細胞相比下降了95%，差異有統計學意義。
　　 (2)相對于SaOS2細胞，TSSC3 mRNA和蛋白的表達在SaOSar細胞中分別下調了56%和55%，差異有統計學意義。
　　 (3)TSSC3的表達在MTF中較hFOB1.19成

27、骨細胞下降了67%，在MTFar中較MTF下降了15%，差異有統計學意義。
　　 綜合以上結果提示TSSC3可能通過表達抑制參與骨肉瘤的失巢凋亡抵抗，進而促進了骨肉瘤的演進。
　　 六、TSSC3通過調控EMT相關分子以及轉移相關分子的表達促進了MET，抑制了骨肉瘤細胞的遷移、侵襲和轉移潛能
　　 1.TSSC3的表達抑制了骨肉瘤細胞的遷移能力：采用細胞劃痕實驗檢測細胞的運動能力，結果顯示：overTSSC3和o

28、ver overTSSC3ar細胞向致傷區(qū)遷移的距離明顯小于各自的對照細胞，而siTSSC3細胞則明顯大于siCON細胞。
　　 2.TSSC3的表達顯著地降低了細胞的侵襲能力：采用Transwell侵襲小室法測定細胞的侵襲能力，結果顯示：overTSSC3和overTSSC3ar的下室細胞數顯著低于各自對照細胞，overTSSC3和overCON分別為8±2和105±16，overTSSC3ar和overCONar分別為40±

29、6和179±26，差異有統計學意義。而siTSSC3的下室細胞則明顯多于siCON細胞，siTSSC3和siCON分別為158±11和30±5，差異有統計學意義。
　　 3.TSSC3的表達對骨肉瘤細胞EMT相關分子以及轉移相關分子表達的影響：
　　 采用熒光定量PCR的實驗方法得到如下結果：
　　 (1)高表達TSSC3增加了上皮標志E-cadherin的表達，同時下調了間質相關標志N-cadherin、Vim

30、entin、Fibronectin以及EMT相關轉錄因子Twist、Snail、Slug、Smadl、Smad4、ZEB1、ZEB2的表達，差異有統計學意義。結果說明：高表達TSSC3使骨肉瘤細胞發(fā)生了MET。
　　 (2)高表達TSSC3降低了轉移相關分子CD44s、CXCR4及金屬蛋白酶家族分子MMP2、MMP7、MMP9、MMP14的表達，同樣在失巢凋亡抵抗細胞中過表達TSSC3也得到了同樣的結果，差異有統計學意義。相反，

31、低表達TSSC3上調了CD44s、CXCR4、MMP7、MMP14的表達，差異有統計學意義。結果說明：高表達TSSC3在基因水平下調了骨肉瘤細胞侵襲和轉移的潛能。
　　 七、TSSC3通過抑制整合蛋白信號傳導激酶Src介導的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而促進了骨肉瘤的失巢凋亡，并增加了失巢凋亡細胞對化療藥的敏感性
　　 1.TSSC3抑制整合蛋白信號傳導激酶Src介導的PI3 K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而

32、通過線粒體途徑促進了骨肉瘤的失巢凋亡：
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察各轉染組細胞懸浮狀態(tài)下的細胞形態(tài)：與對照組相比，overTSSC3細胞團塊較小且松散，有較多散在的凋亡細胞。流式細胞術檢測各細胞懸浮3天的失巢凋亡率顯示：SaOS2、overCON、overTSSC3分別為31.20%、31.00%、47.90%(早期凋亡率)；相反，siTSSC3細胞團塊較大且緊密，散在的凋亡細胞較少。流式細胞術檢測各細胞懸浮1天的失巢凋亡率顯

33、示：siCON、siTSSC3分別為22.70%、3.52%(早期凋亡率)，且siTSSC3細胞的失巢凋亡率與抗失巢凋亡細胞SaOSar相近(8.55%)。結果表明：TSSC3促進了骨肉瘤細胞的失巢凋亡。
　　 (2)JC-1染色，流式細胞術檢測線粒體膜電位的改變，結果顯示：懸浮3天后，overTSSC3 JC-1單體所占的比例為36.5%，明顯高于對照細胞overCON(14.4%)和SaOS2(13.9%)。Western

34、Blot結果顯示：overTSSC3細胞溶質中Cytc的表達量顯著高于overCON，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3破壞了骨肉瘤失巢凋亡細胞的線粒體膜電位從而促進了Cytc的釋放。
　　 (3)熒光定量PCR的結果顯示：高表達TSSC3增加了Puma、Noxa、Bim、Bax、Bak、Cytc、Apaf-1和caspase-3的表達，同時下調了Bcl-2和Bcl-xL的表達，從各個環(huán)節(jié)促進了線粒體途徑的失巢凋亡，差異有統

35、計學意義。相反，低表達TSSC3降低了Puma、Noxa、Bax、Cytc和caspase-3的表達，同時升高了Bcl-2的表達，差異有統計學意義。另外，overTSSC33day細胞中Bax/Bcl-2的比值為5.97，而overCON3day細胞中為0.40，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3通過線粒體凋亡信號途徑增加了骨肉瘤細胞對失巢凋亡的敏感性。
　　 (4)熒光定量PCR的結果顯示：高表達TSSC3同時降低了int

36、egrinβ4與Ezrin的表達，上調了integrinα2、integrinβ1的表達，且TSSC3與Caveolin-1的表達正相關，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3參與調控骨肉瘤細胞失巢凋亡信號途徑中的多個分子。
　　 (5)Western Blot檢測結果顯示：過表達TSSC3使懸浮細胞整合素蛋白信號傳導激酶Src的磷酸化水平降低，P-Akt降低，Akt升高，P-Bad降低，促進了Cytc從線粒體釋放到胞質，cle

37、aved caspase-3升高，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3抑制了整合蛋白信號傳導激酶Src介導的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而通過線粒體途徑促進了骨肉瘤的失巢凋亡。
　　 2.TSSC3通過抑制整合蛋白信號傳導激酶Src介導的PI3 K/Akt信號通路增加了失巢凋亡細胞對化療藥的敏感性：
　　 (1)AnnexinV/PI染色，流式細胞術檢測細胞凋亡率顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉染組細胞3天，

38、SaOS2、overCON凋亡率分別為59.90%、56.90%，而overTSSC3則達到78.60%。結果表明：高表達TSSC3顯著地增加了失巢凋亡細胞對化療藥的敏感性。
　　 (2)JC-1染色，流式細胞術檢測顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉染組細胞3天，SaOS2、overCON、overTSSC3細胞JC-1單體的比例分別為42.8%、35.6%、63.4%。結果表明：高表達TSSC3通過線粒體通路促進了失巢凋亡細胞化

39、療藥處理后引起的凋亡。
　　 (3)Western Blot檢測顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉染組細胞3天，高表達TSSC3降低了化療藥處理后失巢凋亡細胞P-Src和P-Akt的表達，同時增加了cleavedcaspase-3的表達，差異有統計學意義。結果表明：TSSC3通過抑制整合素介導的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號增加了失巢凋亡細胞對化療藥的敏感性。
　　 綜上所述，本研究的主要結論是：
　　 1.印跡

40、基因TSSC3在骨肉瘤中低表達，它通過抑制骨肉瘤細胞增殖和誘導凋亡發(fā)揮抑癌基因作用，其機制可能為通過調控線粒體途徑增加骨肉瘤的基礎凋亡率和化療敏感性。
　　 2.印跡基因TSSC3可通過調控EMT相關分子以及轉移相關分子CD44s、CXCR4和MMP家族分子的表達促進MET，抑制骨肉瘤細胞的遷移、侵襲和轉移潛能。
　　 3.印跡基因TSSC3在骨肉瘤細胞失巢凋亡抵抗逐漸增強的過程中漸進性地表達下調，其機制可能為通過抑制整

41、合蛋白信號傳導激酶Src介導的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而促進骨肉瘤的失巢凋亡，并增加失巢凋亡細胞對化療藥的敏感性。
　　 本研究首次報道了印跡基因TSSC3在骨肉瘤發(fā)生和演進過程中的表達變化、功能及作用機制。從印跡基因的角度探討了骨肉瘤失巢凋亡及耐藥的分子機制。提出了印跡基因TSSC3作為抑癌基因可抑制骨肉瘤細胞增殖、誘導凋亡(包括失巢凋亡)，并通過調控EMT相關分子以及轉移相關分子的表達促進了MET，抑制了骨肉瘤