TSSC3-RanBP9調(diào)控骨肉瘤失巢凋亡及EZH2促進骨肉瘤增殖并影響TSSC3表達的分子機制.pdf

1、骨肉瘤是最常見的骨組織惡性腫瘤，它是導(dǎo)致兒童和青少年癌癥相關(guān)死亡的第二位原因。近年來由于新輔助化療的臨床應(yīng)用，有效地改善了患者的5年有效生存率。但是，骨肉瘤的致死率和致殘率仍然很高，近20年骨肉瘤的治療進展十分緩慢。因此，目前亟需開發(fā)更具靶向性的新的治療骨肉瘤的方法。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟事件，失巢凋亡抵抗是腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的先決條件，與化療藥物抵抗性和不良預(yù)后相關(guān)。因此探討骨肉瘤細胞的失巢凋亡抵抗、化療藥物抵抗和遠處

2、轉(zhuǎn)移的機制將為深入闡明骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移及耐藥提供進一步的理論和實驗依據(jù)。
　　印跡基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)是我課題組利用基因芯片技術(shù)在成骨細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中篩選出的差異表達明顯的基因，它在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。TSSC3可以在體內(nèi)和體外抑制骨肉瘤細胞的增殖，但是TSSC3參與調(diào)控骨肉瘤失巢凋亡以及肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制并不明確。而作為印跡基因，TSSC3的表達主要受表觀遺傳學(xué)機制的調(diào)

3、控，EZH2(enhancer ofzeste homolog2)是介導(dǎo)組蛋白甲基化修飾的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子，它是否參與調(diào)控并抑制TSSC3在骨肉瘤中的表達，目前并無相關(guān)報道。
　　因此，本課題共分為以下兩個部分:
　　第一部分擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)釣取與TSSC3發(fā)生相互作用的蛋白，并采用免疫共沉淀、酵母雙雜交方法驗證兩蛋白的相互作用，明確介導(dǎo)二者相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域;并進一步利用共轉(zhuǎn)染差異表達TSSC3和其相互作用蛋白

4、RanBP9，明確TSSC3與其相互作用蛋白(RanBP9)在骨肉瘤失巢凋亡和轉(zhuǎn)移中的作用和相關(guān)分子機制。
　　第二部分擬采用免疫組化和qRT-PCR檢測骨肉瘤細胞和組織中EZH2和TSSC3表達，并對EZH2對骨肉瘤生物學(xué)效應(yīng)的影響以及TSSC3在其中的作用進行初步研究，目的在于闡明骨肉瘤中EZH2和TSSC3的表達及生物學(xué)意義，以及EZH2對TSSC3的表觀遺傳學(xué)調(diào)控，以期為骨肉瘤的表觀遺傳學(xué)治療提供初步的理論基礎(chǔ)。
　

5、　主要研究結(jié)果如下:
　　第一部分:
　　1.RanBP9是TSSC3在骨肉瘤細胞中新的相互作用蛋白，二者的相互作用由RanBP9的SPRY結(jié)構(gòu)域和TSSC3的PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，且二者在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平均存在相互調(diào)節(jié)的作用。
　　2.TSSC3/RanBP9的表達與骨肉瘤細胞的高遷移、侵襲和失巢凋亡抵抗等表型呈負相關(guān)。
　　3.TSSC3/RanBP9表達與骨肉瘤患者肺轉(zhuǎn)移亦呈負相關(guān)。
　　4.RanBP

6、9與TSSC3在體外實驗中協(xié)同抑制了骨肉瘤細胞的錨著依賴生長、侵襲遷移并促進細胞凋亡，并在體內(nèi)實驗中顯著抑制了骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。
　　5.RanBP9的SPRY結(jié)構(gòu)域在TSSC3/RanBP9復(fù)合物介導(dǎo)的失巢凋亡抵抗效應(yīng)中起重要作用
　　6.RanBP9發(fā)揮其支架蛋白的作用與Src、TSSC3形成一個三聚體，而后抑制Src以及Src介導(dǎo)的Akt通路的激活，并促進內(nèi)源性線粒體途徑介導(dǎo)的失巢凋亡。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了一

7、個新的可以和TSSC3發(fā)生相互作用的蛋白RanBP9，且TSSC3和RanBP9協(xié)同抑制骨肉瘤的失巢凋亡抵抗和侵襲轉(zhuǎn)移，該過程是由依賴Src的PI3K/Akt通路介導(dǎo)的。因此，RanBP9和TSSC3可能均在骨肉瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。該部分結(jié)果可以為以RanBP9和TSSC3雙靶點的骨肉瘤治療提供初步的理論基礎(chǔ)。
　　第二部分:
　　1.EZH2在人骨肉瘤組織和細胞中呈異常高表達。
　　2.EZH2與骨肉瘤臨床病理學(xué)

8、參數(shù)的相關(guān)性:EZH2與骨肉瘤臨床分期、分級和遠處肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，同時EZH2的表達與TSSC3呈負相關(guān)。
　　3.敲低EZH2的表達可以在體內(nèi)和體外抑制骨肉瘤細胞增殖。
　　4.抑制EZH2可以促進骨肉瘤細胞凋亡，抑制其侵襲遷移能力。
　　5.敲低EZH2可以抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。
　　6.抑制EZH2的表達，可以通過抑制骨肉瘤細胞增殖和促進細胞凋亡增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。
　　7.沉默EZH2可以

9、上調(diào)TSSC3的表達，EZH2可能通過組蛋白27位賴氨酸的三甲基化(H3 K27me3)介導(dǎo)TSSC3的表達沉默。
　　8.EZH2通過抑制TSSC3的表達發(fā)揮其促癌作用。
　　綜上所述，EZH2在骨肉瘤中異常高表達，且敲低EZH2后可以在體內(nèi)和體外顯著抑制骨肉瘤的增殖和侵襲能力，而敲低EZH2的上述生物學(xué)效應(yīng)與其對印跡基因TSSC3的表觀沉默作用相關(guān)。因此，EZH2可能在骨肉瘤中起癌基因的作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。該部分實