RNA干擾凋亡抑制基因survivin表達(dá)及對骨肉瘤細(xì)胞系U-2OS相關(guān)生物學(xué)特性的影響.pdf

1、骨肉瘤是人類最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，最常見于20～30歲的年輕人。單純截肢治療患者常常在一年內(nèi)死于肺轉(zhuǎn)移。隨著外科技術(shù)，影像學(xué)、化療放療的發(fā)展，患者長期生存率從10～20％上升到60～70％[1]。但是諸如腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等問題仍然沒有得到完全解決。 隨著腫瘤的研究已進(jìn)入到基因與分子水平，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素參與、多種途徑、多階段的復(fù)雜過程，許多基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演變相關(guān)，包括癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡基因、凋亡抑

2、制基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因等，其中細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)基因，如癌基因、凋亡抑制基因、細(xì)胞凋亡基因等的異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，它能引起細(xì)胞的某些生物學(xué)特性的變化，導(dǎo)致細(xì)胞無限制繁殖和癌變。腫瘤細(xì)胞凋亡抑制因子活性的增強(qiáng)，能抵抗細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，使腫瘤細(xì)胞逃避體內(nèi)免疫系統(tǒng)的識(shí)別和清除，最后導(dǎo)致腫瘤的形成[2]。因此，特異性抑制細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制因子的表達(dá)己成為腫瘤治療新途徑。 細(xì)胞凋亡抑制因子(inhibitorofapopto

3、sis，IAP)家族是一類分布廣泛的抗凋亡蛋白，存在于病毒、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等生物中，家族成員在結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)是具有一個(gè)或多個(gè)高度保守的約70個(gè)氨基酸重復(fù)序列，稱為桿狀病毒IAP重復(fù)序列(baculoviralIAPrepeat，BIR)，在功能上具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。1997年耶魯大學(xué)的Ambrosini等用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體Ⅰ(effectorcellproteasereceptorⅠ，EPRⅠ)cDNA在人類基因文庫中進(jìn)行篩選，

4、克隆出的一個(gè)新基因，命名為survivin。Survivin結(jié)構(gòu)較獨(dú)特，只有單一BIR，羧基末端不含環(huán)指結(jié)構(gòu)，其基因定位于染色體17q25，有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，基因全長14.7kb，編碼產(chǎn)生一個(gè)由142個(gè)氨基酸組成的分子量為16.5kDa的胞漿蛋白，為IAPs中分子量最小的成員[3-8]。Survivin表達(dá)于幾乎所有人類腫瘤組織中，但極少見于正常組織。Survivin區(qū)別于其它IAPs的最顯著的特點(diǎn)之一是在正常和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)不

5、同，它在成熟的終末分化的組織中不表達(dá)，而在多數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中有較高水平的表達(dá)。應(yīng)用免疫組化、Western雜交和原位雜交，檢測survivin基因幾乎在所有的人類癌癥中都有高水平的表達(dá)。研究資料顯示survivin在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、大細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤中高表達(dá)，并與這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系[9-12。Survivin在腫瘤中廣泛分布，提示在

6、腫瘤中sur-vivin基因可能被解除了管制。研究表明在正常組織中survivin啟動(dòng)子的活性非常低[11]。 目前認(rèn)為survivin可能主要通過兩條途徑來抑制細(xì)胞凋亡，其一是通過直接抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7的活性，阻斷各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[13-17]。Lie[9]等研究靶向survivin的反義寡核苷酸對肺腺癌細(xì)胞株的作用，發(fā)現(xiàn)凋亡增加，caspase-3活性提高，細(xì)胞增生受抑制，對化

7、療藥物敏感性增加。其二是survivin與周期蛋白激酶cdk4相互作用阻斷凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路[10]。Survivin依賴的細(xì)胞增殖信號(hào)進(jìn)入核內(nèi)與cdk4結(jié)合，導(dǎo)致Cdk2/CyclinE激活和Rb磷酸化，Rb磷酸化后啟動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入周期，加快G1-S期的轉(zhuǎn)換，同時(shí)使p21從cdk4中釋放出來，釋放的p2l易位到線粒體與procaspase-3形成復(fù)合物，抑制caspase-3的活性，阻斷線粒體釋放細(xì)胞色素c從而抑制細(xì)胞凋亡。Smith等[1

8、8]研究結(jié)果表明，在新發(fā)和復(fù)發(fā)的膀胱癌患者尿液中可檢測到survivin的表達(dá)，敏感性為100％，特異性為95％，呈陽性表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率高，代表預(yù)后較差；因此，檢測尿液中survivin可作為一種早期，非侵入性的膀胱癌的方法。由于sur-vivin在正常分化的組織中不表達(dá)，而表達(dá)于腫瘤組織中，因此腫瘤患者機(jī)體免疫系統(tǒng)將視survivin蛋白為非己蛋白而產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此可在腫瘤患者體內(nèi)的血液中檢測到循環(huán)抗體[19-20]。Survivi

9、n選擇性地表達(dá)于腫瘤組織及其抗凋亡作用成為近年來腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)之一。目前主要是應(yīng)用人工合成的survivin反義寡核苷酸、反義RNA以及負(fù)顯性突變體轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑制survivin表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[21]。 在眾多治療方法的研究中，RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)是最近用于抑制基因表達(dá)的技術(shù)，主要用于基因功能和基因治療學(xué)等方面的研究。RNAi具有抑制作用強(qiáng)、穩(wěn)定性高、細(xì)

10、胞攝取相對容易等優(yōu)點(diǎn)。RNAi在基因功能分析、抗腫瘤和抗病毒基因治療等方面均得到廣泛應(yīng)用[22-25]。它主要利用雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)Dicer內(nèi)切酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切下，產(chǎn)生有活性的長度為21-29nt小的干擾性RNA(shortinterferingRNA，siRNA)，通過堿基互補(bǔ)原理，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。RNAi的發(fā)現(xiàn)為基因功能學(xué)和基因治療學(xué)

11、等提供了有效的研究方法[26]，已被《科學(xué)》雜志評(píng)為2002年最重要科技發(fā)現(xiàn)之一[27]。 RNAi是一種進(jìn)化上保守的基因組水平的細(xì)胞內(nèi)監(jiān)控機(jī)制，dsRNAs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)可以活化兩條途徑：超過30bp的dsRNAs引起廣泛的非特異性mRNA的降解和翻譯的關(guān)閉，體外合成的短的19-23nt的dsRNAs分子模擬RNAi途徑中間體，引起序列特異性的基因表達(dá)抑制[28-32]。研究表明RNAi具有很強(qiáng)的抑制目的基因作用：Paul[

12、33]等應(yīng)用laminA/C的RNAi抑制laminA/C的活性，并與laminA/C的反義寡核苷酸進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，前者具有明顯的抑制作用，而后者的抑制作用則較低。Wilda[34]等在研究RNAi和反義寡核苷酸對熒光素酶的抑制作用時(shí)也得到同樣的結(jié)論。由于RNAi在沉寂目的基因表達(dá)方面的優(yōu)勢，正逐漸取代寡核苷酸，成為新的基因表達(dá)干預(yù)技術(shù)[24]。 本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)，研究在骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS中轉(zhuǎn)染針對survivin

13、的siRNA后，survivinmRNA水平和蛋白表達(dá)的變化，觀察siRNA作用后，對U-2OS細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。本文共分三部分，第一部分：survivinsiRNA在骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS中抑制survivin的表達(dá)；第二部分：Survivin-siRNA誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞U-2OS的凋亡及對其相關(guān)生物行為的影響；第三部分：Survivin和MMP-9在骨肉瘤中的表達(dá)及相關(guān)性研究。 本研究通過實(shí)驗(yàn)得出如下結(jié)論： 1.體