長(zhǎng)鏈非編碼RNA在兒童急性白血病表達(dá)譜及其功能的初步研究.pdf

1、目的：長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）在基因調(diào)控中起重要作用，目前它對(duì)兒童急性白血?。ˋcute leukemia，AL）發(fā)病機(jī)制的影響尚不清楚。本研究采用微矩陣基因芯片技術(shù)，研究lncRNA在AL患兒和正常兒童表達(dá)譜的差異；篩選一個(gè)差異最大的lncRNA：AC002454.1，通過基因沉默技術(shù)對(duì)其進(jìn)行功能的初步研究，為探索lncRNA參與兒童AL發(fā)病的分子機(jī)制提供新的思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　

2、方法：
　　1.對(duì)初治AL患兒9例，其中急性淋巴細(xì)胞性白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)6例，急性髓細(xì)胞性白血病(Acute myelocyticleukemia，AML)3例；正常健康兒童9例。分為6個(gè)樣本，AL患兒：L1（AML3例）、L2（T-ALL3例）、L3（B-ALL3例），正常對(duì)照：C1、C2、C3（各3例）。分別取骨髓/外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA后進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定。合格后雜交合成

3、cDNA，經(jīng)過Microarray基因芯片掃描儀掃描后得到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)軟件轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到AL患兒與正常對(duì)照組之間lncRNA和mRNA的差異表達(dá)譜。
　　2.選取兒童AL中表達(dá)譜差異大于10倍以上的lncRNA97個(gè)，對(duì)21例ALL患兒、22例AML患兒及21例正常對(duì)照兒童，取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，并進(jìn)行引物特異性逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative

4、 polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)，GAPDH做內(nèi)參，循環(huán)閾值(Ct值)比較法進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)定量分析，并與芯片結(jié)果驗(yàn)證。選其中差異最大的lncRNA：AC002454.1分析其表達(dá)量與臨床指標(biāo)的關(guān)系。
　　3.綜合NCBI RefSeq、UCSC、RNAdb、LncRNAs等數(shù)據(jù)庫資源，對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行Gene Ontology、Pathways等生物信息學(xué)分析，并通過計(jì)算Pearson

5、相關(guān)系數(shù)建立lncRNA與靶基因的基因網(wǎng)絡(luò)圖。
　　4.選用白血病細(xì)胞株K562，NB4作為研究對(duì)象，構(gòu)建并轉(zhuǎn)染慢病毒載體下調(diào)AC002454.1表達(dá)，分別采用CCK8法、流式細(xì)胞儀技術(shù)、Western-blot等實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)白血病細(xì)胞株增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響以及CDK6表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1.兒童AL差異表達(dá)的lncRNA2409個(gè)，其中上調(diào)2倍以上1394個(gè)，下調(diào)2倍以上1015個(gè)；差異表達(dá)的

6、mRNA2331個(gè)，其中上調(diào)2倍以上1073個(gè)，下調(diào)2倍以上1258個(gè)。兒童ALL差異表達(dá)的lncRNA1884個(gè)，其中上調(diào)2倍以上的1106個(gè)，下調(diào)2倍以上的778個(gè)；差異表達(dá)的mRNA1857個(gè)，其中上調(diào)2倍以上905個(gè)，下調(diào)2倍以上952個(gè)。兒童AML差異表達(dá)的lncRNA4289個(gè)，其中上調(diào)2倍以上的2215個(gè)，下調(diào)2倍以上的2074個(gè)；差異表達(dá)的mRNA4003個(gè)，其中上調(diào)2倍以上1769個(gè)，下調(diào)2倍以上2234個(gè)。
　

7、　2.qRT-PCR驗(yàn)證兒童AL差異大于10倍以上lncRNA：ALL組顯著上調(diào)9個(gè)
　?。╱c002ehu.1、AC002454.1、uc001guz.2、BC035649、uc001kpt.2、AK123765、NR_026776、NR_027182、ENST00000508489），顯著下調(diào)7個(gè)（ENST00000415964、uc010arh.1、ENST00000457799、ENST00000511213、NR_002

8、712、X61079、ENST00000417930）；AML組中顯著上調(diào)12個(gè)（AC002454.1、uc002ehu.1、ENST00000509150、uc001guz.2、ENST00000457457、uc001kpt.2、NR_027182、AK123765、BC031319、AK124936、uc003hhv.1、NR_026776），顯著下調(diào)12個(gè)（AK027193、AK024584、BC005232、AK094982、

9、uc003ebe.1、ENST00000512129、AF088004、uc002vje.1、uc010arh.1、ENST00000428188、ENST00000457799、ENST00000415964），結(jié)果與芯片一致。AC002454.1相對(duì)表達(dá)量與AL患兒性別、年齡、初診時(shí)WBC計(jì)數(shù)、染色體、融合基因、危險(xiǎn)度分層、預(yù)后等各項(xiàng)臨床指標(biāo)，無顯著性差異（P值均>0.05）。初診AL患兒不同免疫分型的AC002454.1相對(duì)表達(dá)量

10、差異顯著（P<0.05）。
　　3.GO分析顯示，上調(diào)的mRNA：413個(gè)參與生物學(xué)進(jìn)程(Biological process)、90個(gè)參與細(xì)胞組件(Cellular component)、94個(gè)參與分子功能(Molecular function)，分別以細(xì)胞周期（Cell cycle phase）、細(xì)胞內(nèi)（Intracellular part）和催化活性（Catalytic activity）富集程度最高；下調(diào)mRNA：665個(gè)

11、參與生物學(xué)進(jìn)程、59個(gè)參與細(xì)胞組件、118個(gè)參與分子功能，分別以免疫反應(yīng)（Immune response），質(zhì)膜（Plasma membrane）和蛋白結(jié)合（Protein binding）富集程度最高。
　　4.Pathway分析顯示，24條基因通路受上調(diào)的mRNA調(diào)控，富集程度最高的是通路是細(xì)胞周期（Cell cycle），由26個(gè)目的基因組成；32條基因通路受下調(diào)的mRNA調(diào)控，富集程度最高的是通路是造血細(xì)胞系（Hemato

12、poietic cell lineage），由23個(gè)目的基因組成。
　　5.對(duì)表達(dá)差異顯著的10個(gè)lncRNA基因：ENST00000435695(AC002454.1)、ENST00000509150、NR_027182、AK124936、uc003hhv.1、AK027193、BC005232、ENST00000428188、ENST00000415964、NR_002712，通過計(jì)算與目的基因的Pearson相關(guān)系數(shù)(≥0.

13、95)，得到797個(gè)目的基因，并共同建立編碼-非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(Coding-noncoding gene co-expression network)。
　　6.下調(diào)AC002454.1表達(dá)可以抑制白血病細(xì)胞株K562和NB4的增殖（P<0.05）、提高細(xì)胞凋亡率和延長(zhǎng)NB4細(xì)胞細(xì)胞G2/M期。下調(diào)AC002454.1表達(dá)后K562細(xì)胞和NB4細(xì)胞的CDK6表達(dá)水平低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　1.本研究首次采用

14、lncRNA microarray基因芯片揭示兒童AL異常的lncRNA表達(dá)譜，并對(duì)明顯表達(dá)異常的lncRNA采用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與芯片一致。顯示lncRNA microarray基因芯片檢測(cè)是一種理想高效的方法
　　2. AL患兒lncRNA表達(dá)與正常兒童存在明顯差異，發(fā)現(xiàn)并確定了一個(gè)新的基因：AC002454.1在AL各型患兒中異常高表達(dá)，且表達(dá)量與AL患兒的免疫分型相關(guān)，可望成為兒童 AL分型和判斷預(yù)后的分子標(biāo)記

15、物。
　　3.生物信息提示異常表達(dá)的lncRNA、mRNA參與整個(gè)白血病細(xì)胞的多個(gè)生命過程及通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡變，網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。其本身以及它們參與調(diào)控的通路均有可能成為兒童AL基因干預(yù)治療的新靶點(diǎn)。
　　4.體外功能試驗(yàn)提示：下調(diào)AC002454.1表達(dá)可抑制白血病細(xì)胞的增殖能力、影響細(xì)胞周期和提高凋亡率；下調(diào)AC002454.1表達(dá)可影響CDK6表達(dá)，為進(jìn)一步明確AC002454.1生物學(xué)功能、探索lncRNA參