長非編碼RNA PRNCR1在腸癌中的表達(dá)特征及其功能機(jī)制研究.pdf

1、第一部分結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)長非編碼RNA的篩選及鑒定
　　背景: 結(jié)直腸癌是威脅我國人民健康的最主要的惡性腫瘤之一。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association studies，GWAS)研究的廣泛開展，從人類基因組中海量的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）這一角度發(fā)現(xiàn)了大量影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的熱點(diǎn)區(qū)域，深入解析熱點(diǎn)區(qū)域的功能及分子機(jī)制成為當(dāng)前研究

2、熱點(diǎn)。長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個水平調(diào)控生理、病理過程，為解析熱點(diǎn)區(qū)域功能及分子機(jī)制提供了新的視角。本研究旨在結(jié)合GWAS研究發(fā)現(xiàn)的熱點(diǎn)區(qū)域篩選并鑒定結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)lncRNA。
　　方法: 數(shù)據(jù)庫檢測和生物信息學(xué)分析:檢索GWAS catalog中結(jié)直腸癌相關(guān)的SNP位點(diǎn)以及l(fā)ncRNA數(shù)據(jù)庫信息。確定結(jié)直腸癌相關(guān)SNP100Kb范圍內(nèi)的lncR

3、NA。對隨機(jī)抽選的20對結(jié)直腸患者標(biāo)本中差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果: 檢索NHGRI GWAS catalog，結(jié)合Ensembl、GenBank、UCSC等在線數(shù)據(jù)庫，查找出33個潛在的與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA。應(yīng)用高通量多數(shù)據(jù)集在線分析平臺——lncRNAtor，對上述lncRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)豐度進(jìn)行分析，進(jìn)一步篩選獲得8個擬驗(yàn)證lncRNA，分別為CCAT2(ENSG0000

4、0280997)、前列腺癌相關(guān)非編碼RNA1(prostate cancer non-codingRNA1,PRNCR1)、ENSG00000258057、ENSG00000235641、ENSG00000251191、ENSG00000231208、ENSG00000248479、ENSG00000236823。行qRT-PCR檢測了該8個lncRNA的組織水平，除已發(fā)表的CCAT2外，PRNCR1在腫瘤組織中平均上調(diào)約11.63倍且

5、均一性最好。UCSC在線分析顯示lncRNA PRNCR1位于8號染色體短臂2區(qū)，長度約為13kb。
　　結(jié)論: 我們綜合了GWAS catalog中結(jié)直腸癌相關(guān)的SNP位點(diǎn)以及l(fā)ncRNA數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，從中篩選出的lncRNA PRNCR1在結(jié)直腸癌中上調(diào)最高且均一性好，提示PRNCR1可能在結(jié)直腸癌中起著重要的作用，可能是潛在促癌基因，值得深入探討。
　　第二部分 lncRNA PRNCR1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征及生

6、物學(xué)功能
　　背景: 目前，lncRNA是眾多疾病尤其是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在諸多的生物過程中發(fā)揮著重要功能;因此，它的特征及功能不斷被探索。在結(jié)直腸癌中，lncRNA PRNCR1的異常表達(dá)可能與結(jié)直腸癌有關(guān)，但其特異性作用方式仍未知。因此，我們探討了PRNCR1高表達(dá)與結(jié)直腸癌多種臨床病理特征之間的關(guān)系，并在體外和體內(nèi)通過ASO介導(dǎo)的等抑制技術(shù)對PRNCR1在腸癌中的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物功能進(jìn)行了探討，并且分析了PRN

7、CR1上調(diào)與腸癌預(yù)后的之間的關(guān)系。
　　方法: 入組63例經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌患者的癌組織及癌旁組織，qRT-PCR法檢測PRNCR1的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)合成PRNCR1的ASO，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入HT-29、SW480細(xì)胞株，qRT-PCR法檢測干擾后HT-29、SW480細(xì)胞株內(nèi)PRNCR1的轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)驗(yàn)分為Scramble轉(zhuǎn)染對照組和PRNCR1-ASO轉(zhuǎn)染組:CCK8實(shí)驗(yàn)檢測PRNCR1低表達(dá)對增殖活性的影響;Tra

8、nswell實(shí)驗(yàn)和Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測PRNCR1低表達(dá)對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。構(gòu)建裸鼠皮下荷瘤模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評估PRNCR1的功能。ROC曲線分析PRNCR1在結(jié)直腸癌中的診斷價值。生存曲線評估PRNCR1表達(dá)情況對腸癌患者生存的影響。
　　結(jié)果: PRNCR1在CRC腫瘤組織中高表達(dá)（平均上調(diào)10.5倍），并與結(jié)直腸癌大小顯著相關(guān)(p=0.006)。ROC曲線分析提示PRNCR1還可能有效的診斷結(jié)直腸癌(PRNCR1:0

9、.799比CEA/CA19-9:0.651)。PRNCR1高表達(dá)的患者5年生存率顯著低于低表達(dá)患者。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:沉默PRNCR1表達(dá)后，24、48、72、96h實(shí)驗(yàn)組450mm吸光度值較對照組顯著降低(p＜0.05)。同時細(xì)胞被阻滯在G0-G1期，S期分布減少;裸鼠皮下荷瘤模型提示PRNCR1促進(jìn)腫瘤生長。
　　結(jié)論: PRNCR1是結(jié)直腸癌的特異性長鏈非編碼RNA，能促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖，是潛在的診斷性標(biāo)志物，其高表達(dá)可

10、能會導(dǎo)致不良預(yù)后。
　　第三部分 lncRNA PRNCR1促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖的機(jī)制研究
　　背景: 新近研究表明結(jié)直腸癌相關(guān)的lncRNA可通過各種方法參與多種生物過程，包括表觀遺傳調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。PRNCR1首先被發(fā)現(xiàn)于去勢抵抗型前列腺癌中。而在結(jié)直腸癌中，PRNCR1異常表達(dá)同樣會增加腫瘤的易感性。事實(shí)上PRNCR1啟動的信號傳導(dǎo)通路遠(yuǎn)比預(yù)期的功能更強(qiáng)大，如LSD1等。在本研究中我們將著重探討其促進(jìn)腸癌增殖的機(jī)制。

11、r>　　方法: 細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)分離檢測PRNCR1的亞細(xì)胞定位。Western blot檢測干擾PRNCR1后HOXA5表達(dá)水平。RBP結(jié)合能力預(yù)測LSD1可能性大，RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（RNA immunoprecipitation，RIP）評估PRNCR1與LSD1結(jié)合能力。染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunopercipitation，CHIP）實(shí)驗(yàn)檢測LSD1是否可與HOXA5啟動子區(qū)組蛋白結(jié)合。同時行拯救實(shí)驗(yàn)、CC

12、K8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PRNCR1、HOXA5相互關(guān)系及其結(jié)直腸癌增殖中的調(diào)控作用。
　　結(jié)果: PRNCR1表達(dá)主要定位在細(xì)胞核中，并可招募LSD1。參照人腫瘤抑制基因數(shù)據(jù)庫，對干擾PRNCR1后的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，所得到的上調(diào)基因和抑癌基因庫取交集，篩選出7個PRNCR1下游靶基因，再行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)HOXA5被抑制最明顯。RIP和CHIP實(shí)驗(yàn)表明PRNCR1通過綁定結(jié)合并招募LSD1復(fù)合物介導(dǎo)HOXA5啟動子區(qū)域